背景：

在细胞中，RNA具有各种各样的二级三级结构可以让它实现多种功能，包括调控基因的表达，催化一些化学反应以及协助蛋白质折叠等等。在RNA纳米技术和基于RNA的基因表达调控的基础之上，近年来已经有许多研究在活细胞中利用多个精心设计的合成 RNA 的组合相互作用的分子计算系统被开发出来。

近日，波士顿大学的Alexander A. Green等人报道一种不受序列约束的多臂RNA结编码的分子逻辑门控策略用来进行不依赖细胞的诊断策略。其成果发表在Nature biomedical Engineering上。

研究内容：
他们设计了可以响应不同RNA输入的多臂结结构，该结构具有依据输入RNA序列独立实现功能的茎环启动的RNA激活因子（LIRA）基序。接着他们将这个自组装的多臂结整合到了被调控基因的上游实现对基因的选择性调控，下图展示了他们实现这一策略的基本原理。通过控制茎-环臂的长度和数目，他们成功构建出了“锁臂（Locked arm）”和“未锁臂（Unlocked arm）”两种状态。“未锁臂”可直接与输入的RNA相结合，因而被设计成了“或”门，（如下左图所示）；“锁臂”在未被解锁的时候无法与输入的RNA结合，故被设计成了“与”门（如下右图所示）。

输入的RNA和LIRA的环状区域的结合会引发核糖体结合位点（RBS）和起始密码子（AUG）区域打开，进一步会启动翻译的过程。具体实现的过程如下a图所示，输入的RNA链中a区域和LIRA中a*环形区域结合之后，其b区域会与LIRA上方发卡结构的茎部b*区域结合进而会打开其下方一点位置的茎部区域。作者使用NUPACK设计了24种不同序列的LIRA文库，并基于这些序列构建质粒以在大肠杆菌 BL21 Star DE3 细胞中使用 T7 RNA 聚合酶表达输入RNA和 LIRA 转录物。使用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因并使用流式细胞术来检测荧光信号，下图b展示了相应的结果。

在设计的24组序列中，有16组的开关比（ON/OFF）高于50倍，最高可达350倍。在下图c中，他们检测了8组开关比高于50的OFF状态下荧光强度，并与无GFP的细胞自发荧光和一系列先前报道的基于粘性末端的调控方式下的OFF状态荧光强度做了对比，可以看到作者他们的方案可以更好的控制住GFP的表达，让其处于完全关闭的状态。并且，不同LIRA序列之间的交叉启动现象非常弱，在所有进行的非同源交叉测试中，仅出现了低于4%的出现了交叉，在LIRA 22和LIRA 18中出现了5.6%的交叉。因此，LIRA至少提供了15种在体内正交调控基因表达的装置。

鉴于成功构建了15组不受序列限制且互相之间相互影响很弱的LIRA结构，作者进一步构建了多臂的RNA结来实现大肠杆菌体内的分子逻辑门。如下a图所示，作者成功构建了基于三臂结的有两种不同RNA输入的“或”门，b和c图分别展示了在不同输入的情况下，其最终开关比和GFP荧光强度的结果。进一步，作者还构建出了d图中的含有三种不同输入信号的“或”门，其对应的各种输入的结果如e和f所示。

此外，基于这种多臂结构的“与”门也被设计出来，如下图所示。对比前面的设计可以看到，“与”门和 “或”门之间最大的区别在于RBS和AUG的位置。“或”门的RBS和AUG位于主茎上，任意一个分支茎的输入打开都会引起主茎部分的打开实现翻译。而“与” 门的RBS和AUG位于最下游的分支茎上，只有从上游分支依次打开才能做到其完全打开推动翻译的进行。在这里像下图a和d展示的那样，作者也构建了分别需要两种输入和需要三种输入的多臂结用来实现对大肠杆菌的控制。其相应的结果分别展示在图b c和图e f中，可以很清楚的看到，在这种设计的情况下，只有输入全部的信号才能实现RNA的翻译。

基于此，作者已经成功验证了他们设计的RNA茎环结构响应对特异性底物打开，因此，他们进一步将该系统应用于特定RNA的检测中。如下图a和b所示，他们制作了不需要细胞的纸分析系统，该系统含有LacZ ω 蛋白，LaZ的反应底物，当正确输入信号被检测到的时候，翻译出LacZ蛋白，Lac会和LacZ组装成完整的功能蛋白，催化底物反应。作者成功将这种方式应用于包括Zika,DEN等多种病毒的合成RNA靶标的检测中。

总结：

作者开发了一种基于多臂 RNA 结操作的策略，该策略可以实现在翻译水平上的调控。与之前报道的类似系统比起来，该系统不受序列的限制，因此理论上可以被设计成任意合适长度的RNA信号的检测。而且，在没有输入的情况下，该系统的背景信号相比前面基于粘性末端的系统更低，假阳性的可能性更低。通过一些变体的设计，该系统还可以实现“或”门和“与”门的分子逻辑操作调控。此外，该系统还成功结合了LacZ系统实现了不需要细胞的体外纸分析检测，可以实现多种病毒靶标RNA的快速检测。

作者最后希望他们的策略可以被进一步应用于构建有价值的内源性RNA报告系统以及控制细胞状态的分子电路中去，他们也希望基于该策略的诊断方法的特异性和敏感性可以进一步得到提高，其成本也可以得到有效降低，最后未来可以用于应对一些传染病爆发的检测中。

参考文献：

Ma, D., Li, Y., Wu, K. et al. Multi-arm RNA junctions encoding molecular logic unconstrained by input sequence for versatile cell-free diagnostics. Nat. Biomed. Eng 6, 298–309 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41551-022-00857-7