人与自然，似乎从来就没有相安无事过。
不是因为战争，就是因为疫情。
不是因为气候变化，就是因为白色垃圾！
塑料回收，刻不容缓
当今世界，塑料垃圾已经成为和气候变化相提并论的全球议题，不容忽视。日常生活中，我们随手丢弃的各种塑料废弃物，稍有不慎就会造成土壤和海洋污染，甚至最终进入人体。
通过对塑料进行循环回收，是有效避免全球白色污染持续蔓延的有效途径之一。以最广泛使用的塑料聚对苯二甲酸乙酯(PET)为例，高质量的透明可回收食品级PET包装材料，在近二十年来的需求量不断增长。传统的收押金的方式进行回用，已经不能满足这种高质量PET包装材料的需求。因此，将非食品级PET废弃物回收，并用于制造食品级PET包装材料，是一个需要攻克的重大挑战。
先将PET转变为分子单体，然后提纯并重新聚合，从而制造出新的塑料，这是一种“闭环”回收的形式。然而，化学降解过程至少存在以下问题：
1）经济上不可行：能源密集型，成本不低，也不符合当前全球节能降耗的大局。
2）环境上不友好：往往需要大量的碱和酸，势必会产生大量废水，而且是很难处理的那种。
3）工艺上不成熟：目前化学方法回收PET的过程中，非PET材料（如聚乙烯、印刷油墨、标签等）的残留物会在沸腾的乙二醇中形成凝胶，阻碍皂化PET的过滤和进一步处理，无法满足食品级高质量PET包装材料的需求。
因此，无论从经济的角度、环境的角度，还是技术的角度，化学回收方式都还有很长的路要走。
那么，
有没有一条更好的路可以选择呢？
酶降解技术，为聚酯类塑料垃圾的回收提供了一条潜在的绿色方案。已有研究表明，来自酯酶、脂肪酶和角质酶的19种不同的PET水解酶(PHEs)，可以用于PET的酶解聚合。
图. 只有少数PET废弃物可以回收制成食品级可回收聚酯
关键问题
但是现在：
1）还没有一种酶，可以满足工业规模的塑料降解活性；
2）只有少数PET废弃物可以回收制成食品级可回收包装材料。
大多数酶需要在较高的反应温度和面向高度加工的底物时，才表现出较好的降解性能。最著名的工程PETase变体：thermopetase和DuraPETase虽然在一定条件下耐热性和催化活性都有所提高，但在温和的温度下它们的PET水解活性总体仍然较低。即便是一种极具潜力的PET降解细菌，也只对无定形（非结晶）PET膜起作用，解聚是不完整的。后来发现了更多活性更高的酶，但没有一种能在可接受的处理时间内完全分解普通PET废物。
新思路
有鉴于此，美国德克萨斯大学奥斯汀分校的Hal S. Alper等人报道了一种工程变体PET降解酶：FAST-PETase，为常用的PET基产品闭环回收提供了一种优势策略，塑料回收技术，进入了一个新的时代。研究团队基于机器学习算法设计了一种稳健和活跃的PET水解酶，在30- 50℃和一系列pH范围内表现出优异的PET水解活性。利用回收的单体重新合成PET，这一闭环回收过程为酶降解回收塑料提供了工业化规模的可行路线。
技术方案：
使用机器学习系统预测了可能提高酶热稳定性和活性的PET降解酶(PETases)的突变。与野生型和工程型的替代品相比，这种酶具有更好的PET降解活性。
1）机器学习算法设计PET水解酶：通过对突变体进行工程和测试，确定了一种与野生型PETase相比含有5种突变的酶，命名为FAST-PETase，具有优异的催化活性和热稳定性的变异。
2）系统考察了PET水解酶的降解性能：探索了FAST-PETase水解酶在不同温度，不同pH范围内的性能，并分别对晶态PET和非晶态PET的降解性能进行了研究。
技术优势：
1）快速降解：对晶态和非晶态PET均能高效降解
非晶态PET可以直接解聚，而晶体PET需要热预处理转变为非晶态。在室温下一周内或在50°C下一天内非晶态PET可以直接解聚，而晶体含量超过25%的PET需要经过热预处理才能使塑料转变为非晶态。
2）普适性：适用于至少51种未经处理的PET样品的降解
具有处理各种塑料废弃物的能力，对gf-PET，pc-PET，商用塑料水瓶，商用聚酯产品均表现除了较好的降解效果。
3）实用性：可用于塑料的闭环回收，用于食品级包装材料。
通过概念验证，合成了约2.8g无色PET和3g彩色PET，满足食品级包装材料的品质要求。
技术细节
机器学习算法设计PET水解酶
假设高度集中的蛋白质工程方法不能考虑整体稳定性和活性之间的进化权衡，而一个中性的、基于结构的深度学习神经网络通常可以改善酶的功能。为此，作者使用了一个三维(3D)自我监督的卷积神经网络(CNN) MutCompute24来识别稳定的突变。该算法在训练来自蛋白质数据库(PDB)的19,000多个序列平衡蛋白质结构的基础上学习氨基酸的局部化学微环境，并且可以轻松预测蛋白质中野生型 (WT) 氨基酸不存在的位置。使用MutCompute获得了WT PETase和ThermoPETase中所有20个典型氨基酸在每个位置的结构拟合的离散概率分布，将预测的分布呈现在蛋白质晶体结构上（图 1a）以识别WT氨基酸残基拟合不如潜在取代基的位置，然后根据预测概率对预测进行排名（图 1b），使用逐步组合策略总共生成了159个单个或多个预测突变。作者还进一步表征了具有更好催化活性和热稳定性的变异。在这组突变中，有4个突变(S121E、T140D、R224Q和N233K)(图1b)的单独和组合的改良程度最高，因此作者选择这4个突变进行进一步组装和分析。
图1 机器学习指导的预测提高了PETase支架的酶性能
非晶态PET薄膜的酶降解活性
使用这四种突变在三个PETase支架(WT PETase, ThermoPETase和DuraPETase)中组装了所有29种可能的组合。DuraPETaseN233K的Tm为83.5ºC，这为迄今为止报道的最热稳定的PETase突变体，进一步强调了MutCompute识别更高稳定性突变体的能力。接下来使用非晶态PET薄膜评估变体在30-60ºC温度范围内的PET水解活性。对比表明机器学习指导的预测大大增强了所有支架的活动并扩展了工作温度范围（图 1c）。在相同的温度下，PETaseS121E/R224Q/N233K在30和40℃分别比WT PETase（图 1c）的PET水解活性提高了3.4倍和29倍。在这一组中最好的变体被命名为FAST-PETase，在40℃和50℃与单独的ThermoPETase相比其活性分别高出2.4倍和38倍（图 1c）。在50°C时FAST-PETase 显示出所有突变体的最高整体降解，测试96小时释放了33.8 mM的PET单体（图 1c）。在这些条件下FAST-PETase成为温和温度和中等pH条件下原位PET降解的优秀候选。
图2 WT和赖氨酸突变酶的耐热性和PET水解活性
pc-PET的酶降解活性
接下来研究使用替代PHEs的基于机器学习的预测的可移植性和通用性。选择了N233K突变并将这种相应的赖氨酸突变引入LCC、ICCM和类角质酶Cut190。产生的Cut190和LCC的赖氨酸突变变体相对于它们各自的支架（图 2a）都显示出显着增强的热稳定性（ΔTm=7 ºC），而ICCM的赖氨酸突变变体显示出96.3 ºC的Tm。更重要的是这三种赖氨酸突变变体在非晶态gf-PET上的水解活性明显高于它们各自的支架（图2b），从而展示了突变的可移植性。除了模型塑料基质，在未经处理的pc-PET上展示PETase酶的性能也是至关重要的。为此收集了51份用于食品、饮料、药品、办公用品、家庭用品和化妆品包装的塑料产品样本并在50 ℃下用FAST-PETase对这些原料进行了酶处理。尽管它们在各方面存在异质性，但来自这一系列PET样品都能在1周甚至24小时内被FAST-PETase完全降解（图3a）。FAST-PETase的解聚几乎以线性速率发生，同时伴随薄膜的线性质量损失。
图3 FAST-PETase在热成型pc-PET产品的酶解反应中的优越性能
对豆饼容器的时间过程分析（图3b）显示，在16小时内结晶度从1.2增加到7.7%，几乎呈线性衰减。原子力显微镜(AFM) （图3c）和扫描电子显微镜(SEM)进一步描述了FAST-PETase的反应过程，在反应过程中它在pc-PET表面产生越来越深、越来越大的孔导致表面粗糙度和可见的不透明度增加。相比在相同条件下，WT PETase、ThermoPETase、DuraPETase、LCC和ICCM对该pc-PET的PET水解活性大大低于FAST-PETase（图3b）。LCC和ICCM的活性即使在最佳反应温度下仍然比FAST-PETase在50°C的活性分别低4.9倍和1.5倍。进一步的实验分析表明LCC和ICCM在60°C时对该pc-PET膜表现出最高的降解率，但其活性仍低于50°C时FAST-PETase的活性。通过增加净反应体积这种FAST-PETase支持的解聚很容易扩展到未经处理的大块塑料上。
商用PET水瓶和聚酯产品的酶降解活性
接下来试图研究商用PET水瓶是否可以被FAST-PETase酶水解。水瓶是通过吹塑生产的，这使得大多数瓶子在膨胀过程中高度结晶（>25%结晶度）。高结晶的聚合物不易受到酶的攻击。为了更全面地评价酶解聚合测定了瓶子各个部分的结晶度，发现颈和中心相对来说是无定形的（1.2和11.7%结晶度），而瓶子的其他部分是高度结晶度的（25.9到33.8%结晶度）（图4a）。为了评估未经处理的水瓶原始切片的生物降解性，从这些区域中切下或穿孔片段并在50°C下用FAST-PETase处理24小时。结果（图4b）显示在颈部和基底中心区域实现了大量单体的释放，而瓶的其余部分只释放了微量单体(0.09 -0.14 mM)，这表明高结晶度对酶解聚速率有负面影响。进一步比较了FAST-PETase与嗜热酶LCC和ICCM在50-72°C范围内的水解活性。结果表明任何测试的酶和温度都不能有效地解聚高结晶体部分。为了解决水瓶完全降解的挑战，作者使用了简单的热预处理，通过融化整个瓶子然后快速的温度淬火使PET变得均匀无定形。通过使用该预处理瓶上的穿孔膜比较了FAST-PETase和其他PHEs在50-72°C温度下的水解活性（图4）。结果表明，FAST-PETase对预处理过的瓶膜具有良好的解聚效果，在50℃下24 h内可释放出32.8 mM的PET单体，是所有PHEs和温度组合中解聚效果最好的。最后作者证明了一个完整的、非物理破坏的融化的塑料冰球可以在50°C下在不到2周的时间内被FAST-PETase基本上完全降解（图4d）。除了包装材料PET在合成纺织工业中被大量使用。为此评估了FAST-PETase在降解部分商用聚酯产品中的应用潜力。5种不同的商用聚酯产品在50°C下用FAST-PETase处理，相对于用其他PHEs处理的样品，释放出更多的PET单体（图4e）。这表明FAST-PETase可用于快速、有效地降解纺织织物中的PET片段，为从商用聚酯产品中回收PET单体和减少微纤维在环境中的浸出提供了一条潜在的途径。
图4 FAST-PETase解聚PET水瓶和聚酯产品及在PET酶化学回收中的应用
展望
作者基于机器学习算法设计了一种稳健和活跃的PET水解酶FAST-PETase，可在相对“温和”的条件下完全、超快速解聚PET。在室温下一周内或在50°C下一天内非晶态PET可以直接解聚，而晶体含量超过25%的PET需要经过热预处理才能使塑料转变为非晶态。51种未经处理的PET产品样品也被证明可以用这种酶降解，表明它有处理各种原材料的能力。作者进一步展示了FAST-PETase可用于塑料的闭环回收，可生产约2.8g无色PET和3g彩色PET。这项研究为塑料回收，提供了全新的借鉴。
那么，问题来了：这种酶，有望大规模生产吗？
参考文献：
【1】Hal S. Alper et. al. Machine learning-aided engineering ofhydrolases for PET depolymerization.Nature, 2022, 604:662-667
DOI: 10.1038/s41586-022-04599-z.
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04599-z
【2】Eggo U. Thoden van Velzen & GiusySantomasi. Tailor-made enzymes
for plastic recycling.Nature, 2022
https://www.nature.com/articles/d41586-022-01075-6
