突破！Nature BME封面：把多个器官连起来！
奇物论
2022-05-22
可曾记得《我不是药神》中被天价药物格列宁折磨的患者们吗？他们看见了生的希望，却无法拥抱黎明，倒在了名为现实的壁垒面前。肯定有人会疑惑，天价药为什么政府不管？肯定有人会怨恨，药企们吃人不吐骨头。电影反映的是患者的痛苦与社会的残酷，将药企放在了恶的角度，但现实真的如此吗？据美国食品药品监督管理局调查数据显示，每种新药的平均研发周期为 10 年左右，耗资约为 10 亿美元左右，这就是业界“双十”说法的由来。而在高额投资的背后，还蕴藏着极高的风险——在经过动物实验检测确认安全有效后，有高达 90% 的药物在临床人体试验中宣布失败，“夭折”的原因无外乎缺乏疗效或者具有毒性，但无论如何，此前“烧掉”的钱只能变成无法挽回的沉没成本。真的是药企残酷无情吗？药企的定价也只是为了回收前期成本，药企盈利也是天经地义。所以，要真正减少“天价药”，关键在于找到全新的药物开发方法，去减少药物开发成本的比例。经过多年探索，一种能够直接预测人类反应的新型药物建模、测试平台开始逐渐成为学界的研究热点，即器官芯片，即 Organs-on-chips，简称 OoCs。早在 2016 年，该技术即入选达沃斯论坛年度十大新兴技术之一。器官芯片可以模拟接近人体水平的生理功能，同时还能精确地控制多个系统参数，研究人员可以更加直观地研究机体行为，预测或再现药物、病原体和正常微生物组等给人体带来的影响。此技术有望将更多“无效”药物提前筛除，进而降低药物研发时的无效工作与支出。近日，哥伦比亚大学生物医学工程系教授Gordana Vunjak-Novakovic率领其团队报告了一种多器官组织芯片系统的，其中以独立单元模块承载成熟的人类心脏，肝脏，骨骼和皮肤组织并通过再循环血管流连接起来，进以模拟相互依赖的器官之间的功能。每个组织都在独立单元中以其自身适应环境中培养，并通过选择性渗透的内皮屏障分离与公共血管流实现细胞间通讯。作者团队重构了阿霉素在人体中的药代动力学和药效学特征，允许鉴定心脏毒性的早期 miRNA 生物标志物，并增加了临床观察到的 miRNA 反应相对于单独培养的组织和在没有内皮屏障情况下互联组织的预测值。全新的模拟血管循环以及独立组织单元的开发，使得药物代谢研究组织芯片领域实现了全新突破，一个未来可期的方向从此被指明。
多器官组织芯片设计目的旨在允许工程人体组织在较长的培养时间内模拟并维持生理通信，同时保持其各自的表型。为了克服不同组织的不同生理环境，采用了模块化组织室，凭借相同的外部几何形状和定制的内部，无泄漏的点击连接器和端口，可以按任何顺序连接以模拟不同的生理场景。所有组织和内皮在整合前已经单独成熟以建立成体样功能，内皮屏障分隔组织和血管流，并通过含有循环免疫细胞，细胞因子和细胞外囊泡的血流进行连接。模块化设计允许在组织通过质量控制后将其放入组织芯片中，并能够根据精确的实验设计定制组织的类型，数量和顺序进行配置。组织芯片使用蠕动泵以设定的流速和剪切应力单方向再循环培养基。对于来自hiPSCs的组织来很难实现和维持组织成熟，但这是模拟人体生理环境所必需的。我们在组织芯片连接之前先单独构建成熟组织，允许不同组织类型实行不同成熟方案，以及每个组织的质量控制，以最大限度地提高一致性。“心肌”由hiPSC衍生的心肌细胞（CM）和成纤维细胞在锚定在两个辅助弹性柱上的纤维蛋白基质中形成，并在4周逐渐增加强度的电刺激下成熟（图2a），“肝脏组织”由hiPSC衍生的肝细胞聚集体形成，并以纤维蛋白基质包裹支持。“骨组织”通过将人骨髓来源的间充质基质细胞（MSC）接种到去细胞化的骨支架中，并通过3周的诱导使细胞向成骨细胞分化（图2c）。为了进一步模拟溶骨平衡，将原代CD14单核细胞接种到体系中。“皮肤组织”是将人真皮成纤维细胞接种到胶原基质中，加入人角质形成细胞，并在气液界面培养3周，进以形成和成熟分层的表皮组织(图2d)。每个组织室下方是一个弹性网组件，覆盖着内皮细胞来支持MSCs并形成血管屏障。我们发现20μm孔最能支持汇合内皮的形成，并确定较低的剪切应力更有利于维持稳定的血管屏障（图3d和图4c）。我们还确定，所施加的剪切应力可以缓慢促进内皮屏障的建立，并通过暴露于血流动力中使内皮和间充质细胞成熟。此外，这些研究是使用同一供体的hiPSC进行的，从而证明了组织芯片对“芯片上的患者”模型的实用性。可以使用匹配的患者特异性细胞的特点，使得该芯片能够对特定个体在器官和系统水平上进行体外研究。为了证明组织之间的通讯，利用CM转染的hiPSC来生成心脏组织，使之生成绿色荧光蛋白（GFP）标记的CD63外泌体（图3e）。在多器官组织芯片中培养2周后，在所有其他组织与心脏组织下方血管屏障中发现了心脏组织分泌的CD63外泌体（图3f，g，h）。心脏组织受伤后分泌肌钙蛋白，也可以在其他组织隔室中找到（图3l）。将CD14单核细胞纳入血流体系，仅在多器官组织芯片中观察到单核细胞对损伤组织的选择性浸润，而混合组织芯片显示为非选择性浸润（图3i，j）。单核细胞也积聚在受伤组织下方的内皮层上（图3k）。图 通过血管屏障和血管流动的组织特异性与多器官通讯多器官组织芯片中的所有组织都保持了“金标准”（孤立组）的结构，功能和分子稳定性，并且在血管流整合后的4周内显着超过混合组的相应组织特性（图4）。具体而言，与混合组相比，多器官组和孤立组的心肌显示出增加的细胞伸长率和条纹。多器官组和分离组的骨组织表现出成熟的溶骨表型，而混合组的骨组织显示出胶原沉积减少。多器官组和孤立组肝组织形态相当，混合组肝组织形态较差。在多器官组和孤立组中，皮肤的表皮层保持完整，而混合组织芯片显示破坏（图4a，b，g）。通过全蛋白质组分析，我们在每个工程组织中检测到数千种蛋白质，这些蛋白质在多器官和混合培养基条件之间差异表达（图4d-g）。值得注意的是，多器官和分离培养中所有组织之间共享基因主要与正常的生理功能（例如，新陈代谢）相关，而混合条件下的共享基因主要与脱靶器官功能相关（图5a）。根据人类蛋白质图谱，鉴定成人和工程组织中表达的组织特异性蛋白质，并将其转化为高、中、低表达水平，工程组织显示出与人体组织的基因表达高度重叠（图5b）。进一步的分析表明，多器官组织芯片中的工程组织与成人心脏，肝脏，骨骼和皮肤中高丰度的基因库更匹配（图5c），证实了多器官组织芯片在培养4周内保持连接组织生物保真的能力。
多器官组织芯片在培养4周内建立了组织特异性功能以及组织连接后，进行了药物的体外模拟。为了显示阐明治疗药物的PK和PD的能力，我们模拟了阿霉素的心脏毒性模型。多器官组织芯片中阿霉素和多柔比星的时间浓度曲线（图6）表明，该模型与实验数据非常匹配，正确预测了阿霉素通过肝脏组织代谢成多柔比星，并随着时间的推移扩散到组织腔和储库中。混合组织芯片中阿霉素和多柔比星的浓度曲线（补充图9）达到峰值的速度比多器官组织芯片更快，可能是由于在没有内皮屏障的情况下对药物运输的屏障作用较小。然后，研究人员研究了多器官组织芯片是否能够通过将所有组织芯片暴露于相同浓度的阿霉素（30μM）72小时内来研究阿霉素PD模型。各个组织的实验数据均与临床表现出良好的匹配性。miRNA方面，多器官组织芯片中（通过GSEA）呈现了有统计学意义的相关基因表达活化或失活，与17个临床相关miRNA中的10个一致。具有内皮屏障的孤立心脏组织表现出类似的反应。相反，在混合组织芯片中，只有5个与已发表的结果一致（29.4%），而12个显示出与临床观察相反的差异活性。这些数据表明，组织的多器官通讯，内皮介导的分配和代谢处理对阿霉素的治疗反应有显着影响，而这些功能是混合组织芯片所不能模拟的。图 多器官组织芯片中阿霉素治疗的实验数据和PK模型多器官组织芯片在4周的培养中通过血管流动连接的明显不同人体组织（心脏，肝脏，骨骼，皮肤）并维持了其成熟表型。内皮屏障为每个要培养的组织提供了特定的优化环境，同时允许细胞因子，循环细胞和外泌体进行通信。这些条件让我们相信，进一步对多器官组织芯片研究可能会建立一套更加优异的患者特异性的系统病理学模型，用于测试新疗法和药物毒性的早期生物标志物。此外，多器官组织芯片将大大受益于高通量检测，以更好地控制多组织同位化，药物递送和采样，并获得更优异的定量读数。为了增加通量，未来工作的方向可以在96孔板大小面积上采用更具可扩展性的组织芯片版本，以实现自动化处理以及与现有成像系统和仪器的兼容性。然而，这种组织芯片也有局限性。目前只囊括了四种组织，不包括其他可以影响药物PK / PD的几个重要器官（肾脏，肠道，脂肪），而它们的功能对于全身作用的药物的研究很重要。同时未来的工作还应继续验证该模型，包括阿霉素和其他药物的不同给药途径，给药方案，代谢和消除。同时，芯片设计与材料运用有待优化，在心室模块中阿霉素可能被聚二甲基硅氧烷吸收，进而影响到药代模型的准确性。由于本次模型重点是预测阿霉素诱导的心肌病，因此选择了单次高剂量阿霉素的用药。然而，评估长期较低剂量和不同药物配方的效果对于临床用药研究也非常重要。Kacey Ronaldson-Bouchard, Diogo Teles, Keith Yeager, et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 2022 Apr;6(4):351-371.https://www.nature.com/articles/s41551-022-00882-6
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