2014年，哈佛大学的Peng Yin和William Shin课题组一起报道了一种叫做DNA-PAINT新的超分辨技术（DOI：10.1038/nmeth.2835）。PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography，用于纳米形貌成像的点聚集）技术是一个使用快速和瞬态染料一次捕获多个荧光点的过程。其依赖于荧光分子与配体的随机动态结合，而不是永久结合的荧光团的随机光激活。DNA分子的杂交是一个动态平衡的过程，因此带有荧光基团的DNA被用来实现PAINT的过程，杂交集合到靶标DNA上的荧光探针与游离的荧光探针之间的荧光信号有很大的差异，进而实现了对靶标结构的超分辨成像。然而，常规的DNA-PAINT仍然存在很多限制（图1a 左上 ）。首当其冲的一点，由于这个方法本身的局限性，DNA-PAINT会存在较强的背景信号，为了尽可能降低这个问题的影响，常规的DNA-PAINT往往会借助TIRF（全内反射）结构光来增加信噪比，这样的做法会让成像的范围局限在玻片的表面，难以实现三维层面的成像。后续人们为了降低背景信号也对这个技术做出了一些改进，例如基于FRET的DNA-PAINT（图1a 右上）和通过设计含有茎环结构的分子信标来降低未结合探针信号（图1a 左下）的策略。然而，基于FRET的DNA-PAINT被证实其定位的精度还要低于常规的DNA-PAINT，而基于茎环结构探针的DNA-PAINT会降低探针和靶标结合的速率从而导致成像速率的受到很大的影响。基于以上的背景，来自耶鲁大学药学院的Joerg Bewersdorf教授和他的合作者们一起提出了一种简单有效的Fluorogenic DNA-PAINT策略来改进现有的DNA-PAINT技术以实现更快更高分辨成像的目的。
他们的方案如图1a 右下所示。他们的设计原理与此前的茎环结构分子信标类似，通过在DNA链的两端分别修饰荧光基团（Cy3B）和淬灭基团（BHQ2），对没有结合到靶标上的探针而言，淬灭基团会很大程度上降低其荧光信号从而提升信噪比。与此前的茎环结构不同，他们的探针并没有去设计这种二级结构，但由于单链DNA本身是柔性分子，因此自由状态下探针的荧光信号会得到很大程度上降低，如图1b所展示的，在未结合状态下探针的信号不足结合状态下探针信号的2.5%。也正因为没有二级结构的存在，探针和靶标的结合速率相比此前具有茎环结构的探针而言会快很多从而在一定程度上提升了成像速率。为了保证结合上去的探针可以正常发光，就必须保证结合状态下淬灭基团和荧光基团之间具有足够的间距。这就对互补靶标和探针分子互补配对区域的长度有了一定的要求，理论上至少需要15个碱基对的长度。但是想实现高速成像需要靶标和探针配对区域短于10个碱基对的。为了同时实现高速结合以及高效发光，他们在配对区域之中引入了一些错配，在保证间距的同时也进一步提高了结合速率。如图2所示，他们分别用他们的方案和常规DNA-PAINT对固定的微管进行成像，原本需要8小时的成像用Fluorogenic DNA-PAINT仅仅20分钟就可以实现。图2 常规DNA-PAINT与Fluorogenic DNA-PAINT的对比为了测试他们的系统，如图3他们首先构建了一个具有48个结合位点的环状DNA折纸结构并用他们设计的方案对其进行TIRF成像，他们分别在1分钟，3分钟，7分钟的时候采集了图像，并对结果进行平均之后得到环状结构的测量直径是60.5±2.0 nm。这与他们设计的理论值62nm是相吻合的。图3 Fluorogenic DNA-PAINT对环形DNA折纸结构的高速成像此外，他们想知道他们设计的新系统是否可以摆脱传统DNA-PAINT必须依赖TIRF结构光的问题，从而实现一定程度上的3维成像。在明场下找到想检测的区域后，他们可以仅使用10 nM浓度的探针在10分钟内完成高质量3维微观网络的超分辨成像。图4 不依赖特殊结构光的迅速3维Fluorogenic DNA-PAINT成像为了进一步拓展这个方法用于多色成像，他们设计了另外一组与之前所用探针-靶标相正交的新的探针，并使用ATTO 643和Iowa Black FQ标记新的探针。最终，他们实现了10分钟之内在U-2 OS细胞中内质网和线粒体的双色成像，并且没有借助特殊的光学结构。总的来说，作者在已经现有的DNA-PAINT技术的基础上通过一些简单的改动，实现了降低背景信号同时又可以高速成像的目标，并且，该方法可以一定程度上帮助DNA-PAINT摆脱结构光的限制，还可以实现多种靶标的同时成像。也正因为用到的成像链对和靶标是部分互补配对的，因此任何一个靶标都可能可以有多种潜在的成像链。虽然有诸多优点，但是这个方案也存在其固有的缺点。因为靶标和成像链并不完全配对，对一些特定的序列很接近靶标，这个方法或许没有很好的识别能力。但是瑕不掩瑜，总的来说，这个方案还是对DNA-PAINT技术一个很大的补充。Chung, K.K.H., Zhang, Z., Kidd, P. et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01464-9
