第一作者：Sarah L. Lovelock

通讯作者：Anthony P. Green, Donald Hilvert, David Baker

通讯作者单位：曼彻斯特大学, 苏黎世联邦理工学院, 华盛顿大学

实现从头设计酶催化剂有助于化学、生物技术、医药等领域的发展，在过去的十年间，伴随着蛋白工程技术的快速发展，人们开始相信有可能逐步实现这个目标。

人们通过发展含有金属辅酶和新型有机官能团的人工酶，展示了如何调控蛋白结构实现利用非蛋白元素的反应活性。同时，基于稳定过渡态原理，通过计算化学方法设计各种催化反应的催化剂。虽然一些成功设计的催化剂表现的催化活性仍非常弱，但是通过实验室进化，得到显著增强的酶催化活性。通过结构分析，发现高精度对于设计高活性催化剂至关重要。因此，目前人们发展深度学习等蛋白设计方法用于改善模型的精度。

有鉴于此，曼彻斯特大学Anthony P. Green、苏黎世联邦理工学院Donald Hilvert、华盛顿大学David Baker等报道在过去十年间酶设计和工程化领域的最新进展，对该领域的发展前景进行展望。

酶催化剂和人工构建酶催化剂

酶催化剂是一种具有复杂催化活性位点的高活性催化剂，酶催化剂通过复杂的催化活性位点进行化学转化。酶催化剂的重要作用是能够显著的提高催化反应的速率，具有其他方法无法比拟的选择性，酶催化剂更加符合可持续发展需求。

近些年，酶催化剂在多个方面和方法学上取得进步：能够以快速、准确和低价格的方式合成DNA并且分析DNA序列，发展了先进的生物信息技术和计算模型，建立了用于高通量结构表征和生物化学酶催化性能的复杂实验工作流，通过这些发展赋予天然酶丰富和多元化的催化功能。通常天然酶无法直接应用于化学合成过程，需要进行蛋白工程进一步的优化，才能够应用于化学操作过程。这些年间，通过高通量蛋白工程方法的发展，生物催化剂能够对非天然底物进行高效率和高选择性的催化，并且能够发展兼容实用化操作步骤的催化剂。

图1. 酶催化剂的设计：自上而下法 (a) vs自下而上法 (b)

目前的发展局限

由于蛋白进化面临耗时和费力的问题，限制了生物催化剂应用于工业化操作过程，而且许多化学催化反应过程还没有合适的起始分子能够进行进化和优化。针对这种局限性，人们发展了超高通量筛选方法和连续进化技术，显著改善蛋白工程化的过程，而且人们发现，通过机械性的混杂酶能够实现自然界不存在的催化反应过程。目前这些方法只适用于少数化学转化过程，还没有普适性的解决方案。由于这些问题，需要人们进一步的发展，才有望实现快速可靠并且价格合理的生物催化剂。

主要内容

图2. 从头设计金属酶

通过自下而上/蛋白从头设计（bottom-up or de novo enzyme design），能够发展出完全不同的新型催化活性中心，为未来生物催化剂在发展速度和范畴上提供一种普适性的解决方法。

作者对目前自下而上/蛋白的从头设计过程中关键的发展进行总结，包括人工金属酶催化剂、包含有机功能团催化剂的酶、第一性原理从头计算设计几个角度，讨论目前设计方法的局限，并且提出如何解决这些问题和挑战。

人工金属酶

通过使用具有氧化还原活性、自由基催化、官能团催化转化的金属离子辅酶，天然酶的催化功能得到显著拓展。通过金属辅酶和蛋白质骨架之间的协同作用，显著改善催化转化反应的速率。将含有预先组装的过渡金属复合物组装到特定蛋白质骨架结构是一个非常有效的方法，这种方法被广泛的应用于一些重要的非生物催化过程的催化剂：烯烃复分解和转移氢化催化反应。

相比而言，在蛋白、底物、过渡金属复合物之间产生有助于催化反应过程的相互作用具有非常大的挑战，通常复合结构催化剂的催化活性往往低于小分子单独催化剂。

因此，将天然金属酶安装到含有新型功能基团的蛋白结构，并且与其本征辅酶配合催化是另外一种方法。尤其是在发展血红素铜氧化酶和一氧化氮还原酶上得到非常重要的进展，具体是通过对血红素蛋白的远端口袋的Cu_B位点、Fe_B位点进行工程化，得到的杂核金属酶能够简单的组装到小型蛋白质骨架结构，而且能够进一步工程化，能够晶化和进行高分辨结构表征。

通过从头设计金属酶，构建与金属辅酶结合、调控催化过程的新型蛋白质骨架结构，为完全控制金属蛋白的次序、结构、功能提供广阔的机会。比如目前大部分研究关注于将金属离子/金属卟啉辅酶组装到设计的α-螺旋结构用于催化氢化反应、氧化还原反应、卡宾转移反应。

新型氨基酸基团

图3. 通过新型氨基酸组分设计酶催化剂

通常设计酶的结构基于含有少数几种功能团（20种经典氨基酸），这限制了从头设计催化活性位点和催化机理的可能性。目前，通过遗传密码扩展方法（genetic code expansion methods）能够对其他更多的氨基酸结构ncAAs（noncanonical amino acids）组装和构建蛋白质，这为蛋白质的设计提供丰富的官能团种类。这种方法通常使用正交酰胺tRNA合成酶-tRNA对实现ncAA的组装。ncAA为从分子级别解释酶催化的工作机理提供可能，而且可能改善生物催化剂的催化活性和稳定性，同时为设计非天然机制的酶提供机会。

稳定过渡态

图4. 模拟计算化学设计酶催化剂

为了将新型功能团引入蛋白质，需要基于酶能够稳定过渡态的基本工作原理进行设计，因此目前人们研究研究哺乳动物免疫系统产生抗体并且形成稳定的过渡态类似物的现象，这个过程种能够产生化学抗体用于多种多样的化学转化，但是抗体的效率无法达到酶催化的性能，而且一些耗能反应无法通过这个过程进行。

最近，计算化学酶设计技术的出现成为一种强有力的方法，这种方法不依靠过渡态是否完美，而且不局限于抗体的折叠。在一些研究中，通过计算模拟设计酶、直接进化方法进行结合，成功的发展了性能接近天然酶的生物催化剂。

前景与展望

通过设计酶的方式达到或者超过目前广泛实用的自上而下生物催化剂发展，需要克服两个关键性的挑战：学习和设计如何发展类似天然酶催化体系能够达到的催化效率；进一步拓展酶的从头设计的领域，发展能够应用于大规模化学转化的催化剂。

总之，目前仍然存在比较多的困难和需要克服的挑战，但是作者认为，实现可编程设计的催化剂在未来是能够实现的。作者在本文综述中说明，只有通过实验、理论计算、生物学、有机化学、酶分子学、结构生物学、蛋白设计、直接进化等多个学科的交叉与配合，才能够实现这个宏伟目标。

图5.发展和设计酶催化剂

参考文献及原文链接

Sarah L. Lovelock, Rebecca Crawshaw, Sophie Basler, Colin Levy, David Baker, Donald Hilvert & Anthony P. Green, The road to fully programmable protein catalysis, Nature 2022, 606, 49-58

DOI: 10.1038/s41586-022-04456-z

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04456-z