三维 (3D) 培养中的干细胞可以自我组织成复杂的多细胞结构，称为类器官，类似于它们所源自的器官的解剖和功能单位。通过提供一种在传统细胞培养方便的情况下概括体内生理系统复杂性的方法，类器官已成为研究生物医学应用中各种器官的发育、健康和疾病的有利研究平台。在传统的实验室环境中，形成类器官的最常见方法是将多能干细胞或成体干细胞嵌入细胞外基质 (ECM) 水凝胶（如 Matrigel）的液滴中。当提供含有特定可溶性因子的培养基时，3D 环境会诱导分化细胞分离成不同的区域并进行命运规范，从而导致它们自发组织成器官样结构。

这种传统方法中的类器官形成过程依赖于被动扩散来提供养分和去除废物。然而，随着类器官的继续生长和对代谢的要求越来越高，营养物质和氧气向 3D 支架内部区域的有限扩散导致形成坏死核心，细胞活力大大降低，最终通过整个水凝胶结构传播。这种退化过程发生的速度取决于类器官的类型及其生长速度。例如，在肠道类器官的情况下，大量的细胞死亡在 10 天内变得明显。在现有的培养方案中，通过每 5-7 天传代类器官来防止这个问题，但每个培养周期的这种短暂持续时间被认为是一个关键问题，因为它对建立长期不间断、连续的类器官培养提出了根本性挑战，这是它们持续成长和成熟所必需的。

为了应对这一挑战，研究人员使用生物反应器来改善扩散运输并建立类器官的长期培养，以促进它们在体外的持续发展。然而，在常规实验室环境中实施这种技术需要昂贵的资本设备，这些设备机械复杂，需要专门的操作和维护知识。虽然已建议将类器官的血管化作为一种替代策略，但生成具有受控血管灌注的类器官模型的过程非常复杂，并且通常需要先进的培养系统和专门的体外技术，而这些技术对于非工程师来说是不容易获得的。

成果简介

鉴于此，宾夕法尼亚大学Dan Dongeun Huh等人提出了一种令人兴奋且有前途的策略来培养具有增强细胞多样性和功能的肠道和其他类器官。他们开发了一个简单、可立即部署的模块化平台（OCTOPUS，Organoid Culture-based Three-dimensional Organogenesis Platform with Unrestricted Supply of Soluble Signals），可以缓解营养物质和氧气的均匀扩散，从而生长出更大、更好和更复杂的类器官。

制备简单！

该系统被制造为简单的培养插件，可以在标准细胞培养板中使用，无需对已建立的协议和工作流程进行任何修改。从本质上讲，该方法可以概念化为（1）从水凝胶液滴中去除坏死核心，同时保持外层含有可行的类器官；（2）径向分割剩余层并将其展开以形成类器官的平面阵列。通过减少培养支架的厚度，该阵列旨在允许营养、氧气和其他可溶性因子不受限制地快速扩散和补充。

图|类器官培养

为了实现这个想法，研究人员创建了一个圆盘形设备，可以在标准细胞培养板中生产径向排列的类器官阵列。OCTOPUS由八个相同的培养室组成，其横截面尺寸为 1 mm× 1 mm。重要的是，培养室对外部环境开放，并包含从开口边缘突出的微小台阶。在这个系统中建立了类器官培养只需要两个简单的步骤。

1）首先，悬浮在水凝胶前体中的干细胞通过入口移液到中央室，并均匀地分布到培养室中。在此过程中，表面张力的作用是将液体弯月面固定在台阶上，从而使注入的溶液前进并充满整个腔室，而不会通过开口溢出。

2）凝胶化后，将培养基添加到包含装置的孔中，以通过暴露的水凝胶表面为嵌入的细胞提供营养供应 OCTOPUS 设计为可移动的培养插入物，使该系统易于转移，便于处理和分析培养的类器官。

格式可定制

另外，也可以很容易地改变培养室的数量、大小和形状，这提供了一种控制在该系统中生成的含有类器官的组织结构的体积和空间组织的方法。同样，OCTOPUS 的设计可以通过在同一设备上创建可单独访问的培养室来修改以生长两种或多种类型的类器官。此外，OCTOPUS 的整体尺寸和形状可以根据标准培养板的不同孔尺寸和格式进行定制，为可扩展的类器官生产和实验提供机会。

图|使用 OCTOPUS 进行常规类器官培养的几何工程

培养时间长达3周！

研究人员展示了使用小鼠成体干细胞衍生的肠道类器官可以延长肠道类器官的维持时间并提高其成熟度。与传统培养方法（包括液滴和单层）相比，体外培养产生了长期可行的类器官和更快的生长。OCTOPUS 允许肠道类器官的长期发育长达 3 周，无需传代，而在传统培养中可以达到 5-7 天。与基于液滴的培养物相比，在OCTOPUS培养物中可以观察到具有增加的隐窝样结构域长度的恒定出芽，并且与增殖细胞（包括 LGR5+ 细胞）的活性增加有关。这些增殖性上皮细胞在培养 14 天后在隐窝样结构域的底部自组织。有组织的隐窝绒毛样轴的形成也与分化标志物表达所描绘的细胞多样性增加有关。

图|长期培养对OCTOPUS肠道类器官成熟的影响

图|OCTOPUS 人类肠道类器官的长期培养

值得注意的是，观察到调节肠道屏障功能的上皮转运蛋白的表达更加稳健，例如肽转运蛋白 1 (PEPT1) 或钠-葡萄糖连接的转运蛋白 1 (SGLT1)。增加的 ATP 活性和更高浓度的葡萄糖诱导的胰高血糖素样肽 1 (GLP-1) 和粘蛋白-2 (MUC2) 分泌的释放进一步证明了类器官功能成熟度的提高。因此，长期的类器官培养使作者能够捕捉到传统 ECM 液滴培养中未见的事件。

模型更加成熟

在 ECM 液滴培养中不太可能观察到人类肠道类器官随时间的自发和稳健分化。为了指导上皮细胞的命运，有必要改变培养基的组成，包括 WNT 和其他信号通路。于此，使用 OCTOPUS，人类肠道类器官可以成功生长一个多月，而无需传代或培养基配方变化。单细胞 RNA 测序实验证实，随着肠上皮细胞向成熟肠细胞分化，细胞多样性增加。此外，发现更多的肠干细胞在隐窝样结构域的底部具有生理定位。研究结果显示，与类器官相比，OCTOPUS 培养物中促进人类肠上皮细胞分化的生长因子分泌更多，例如胰岛素样生长因子1 (IGF-1) 和成纤维细胞生长因子 2 (FGF-2)在ECM 液滴中。这些发现得到了先前研究的支持，该研究表明补充 IGF-1 和 FGF-2 的培养基可以增强上皮分化并增加细胞群异质性。

图|OCTOPUS 中人类小肠的 scRNA-seq

最后，该平台的优势和多功能性通过对患者特异性炎症性肠病 (IBD) 进行建模来体现。研究人员通过添加包含来自 IBD 患者的内皮细胞、成纤维细胞和肠道类器官的细胞微环境来构建设备的复杂性。由此产生的系统显示出比单独生长的人类肠道类器官更持久和稳健的 IBD 表型。

图|OCTOPUS中基于类器官的人类 IBD 模型

图|OCTOPUS-EVO 中血管化人小肠的微工程

小结

综上所述，该研究提出了一个简单、灵活和可自动化的平台，可以在该平台上长时间同时生长组织特异性类器官或多种类器官类型。这个新平台可以提高我们培养类器官的能力，并帮助我们了解在体外设计更好的器官所需的环境参数。ECM 隔室的几何工程至关重要，并且对于使类器官更接近生理现实是必要的。OCTOPUS的未来迭代可能会解决进入管腔的问题。对于生物学家和工程师来说，这是一个激动人心的时刻，因为在我们学科的十字路口，我们可以以最可靠的方式共同实现类器官，甚至可能是器官工程。

参考文献：

1. Park, S.E., Kang, S., Paek, J.et al. Geometric engineering of organoid culture for enhanced organogenesis in a dish. Nat Methods 19, 1449–1460 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01643-8

2.Hillion, K., Mahe, M.M. Redesigning hydrogel geometry for enhanced organoids. Nat Methods 19, 1347–1348 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01656-3