2022年的诺贝尔奖获得者Dr. Sharpless和Dr. Meldal大约在20年前开发的叠氮化物和炔烃之间的铜催化反应由于其简单高效的“品质”被誉为点击反应“皇冠上的明珠”，并已成为药物研发以及生物医用等领域极具吸引力的合成路径之一。而近年来，纳米孔作为一个单分子检测技术，由于其极高的空间分辨率与较为直观的检测原理，已经形成一个体系较为完整且功能独特的单分子生物传感手段。目前纳米孔单分子技术已经被应用于基因测序，蛋白检测以及分子识别等诸多领域。

不同领域的交叉和融合总能带来惊喜。近日，美国南卡罗来纳大学的生物传感和生物标志物研究小组就巧妙的将点击化学和纳米孔技术相结合，发展了一种“CAN”检测方法（Click Chemistry Amplified Nanopore Assay）: 点击化学将HIV 抗原p24信号放大并转化为DNA信号，并通过纳米孔实现了该生物标志物的灵敏检测和定量分析，临床样本的概念性验证结果表明了该策略在HIV检测中的发展和应用潜力。相关成果以“A click chemistry amplified nanoporeassay for ultrasensitive quantification of HIV-1 p24 antigen in clinicalsamples”为题近期发表在Nature Communications 杂志。

研究人员首先用捕获抗体修饰的磁珠将p24抗原从人血清中分离出来，接着利用连接CuO纳米颗粒的检测抗体与以上分离物形成三明治结构，建立了抗原和CuO颗粒的对应关系；随后通过酸处理将该结构上的CuO溶解释放出Cu离子; 随后用富集的Cu离子催化叠氮金刚烷（1-Azidoadamantane, AA）和炔基修饰的单链DNA发生点击反应形成更容易通过纳米孔的DNA-AA结构，实现了p24抗原信号到DNA-AA信号的转化。

CAN 策略的工作示意图

为了提高用于量化抗原的DNA-AA结构通过纳米孔时的特异性, 研究人员借鉴了金刚烷和瓜环（CB[6]）的主客体效应，最终构建了DNA-AA@CB[6]探针，赋予了该结构穿过纳米孔时的特异性信号—振荡信号。形象地说，如果把纳米孔比作一个T台秀场，DNA-AA@CB[6]结构的每次出场都会摆出自己专属的“pose”. 这些特异性信号极大程度的简化了纳米孔电流阻塞信号的处理，提高了检测的特异性。

研究人员进一步在三明治结构中引入生物素和亲和素，实现了从抗原信号到CuO颗粒信号的二次放大；在借助质谱深度解析Cu离子与DNA-AA的正相关关系后，最终通过α-溶血素生物纳米孔(α-HL）建立了抗原与DNA-AA@CB[6]特征信号频率之间的线性关系。在对人血清中p24的检测实验中，该方法的最终检测限能达到0.5pg/mL.

研究人员将研发出的“CAN”策略分别与临床用的第四代HIV检测试剂盒（ELISA）以及基于Cu发光团簇的检测方法进行了肩比肩试验对比，结果显示“CAN”策略的灵敏度高于对比方法多达20-100倍。最后，该方法被进一步应用于118个艾滋病相关的临床样本检测中，并得到了与其它临床HIV标志物发展相似的趋势，且在低浓度p24样本中展示出了相比ELISA的明显优势, 其灵敏度达到了87.3%, 而ELISA检测灵敏度仅为18.2%。

CAN 策略与ELISA在118个临床样本中的对比验证实验

随着科学的不断创新和进步，医疗体系中已经发展出了很多应对和治疗HIV的方法, 但进展仍旧缓慢。报告显示，仅在2021年，全球就有65万人死于艾滋病。按照目前的发展趋势，到2025年每年的新增感染人数将超过120万。因此HIV早期感染的检测以及预后的监测尤为重要。“CAN”策略的发展无疑为推动HIV的早期检测以及其它疾病标志物的检测提供了新的思路。值得一提的是, 前人栽树，后人乘凉，来自中科院化学研究所的吴海臣研究员团队在点击化学与纳米孔结合检测标志物的方向上的早期工作为本研究中“CAN”体系的建立和优化奠定了坚实的基础。目前该联盟策略已经被尝试应用于多种疾病标志物的检测和研究中。然而, 如何将该技术推动到现实世界的应用中，研究人员还有很长的路需要探索。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34273-x

研究小组简介：位于美国南卡罗莱纳大学的生物传感和生物标志物研究小组由刘畅教授主导，致力于发展与纳米材料、纳米孔、微流控、生物传感与器件、分析化学、单分子检测等领域相关的生物工程技术.以上工作主要由卫小军博士主导完成。目前课题组全面开放博士后以及全奖博士生等职位。欢迎相关领域的同学加入。

详情请见：https://www.biosensingandbiomarker.com/