营养对生长至关重要，在幼年生长期由于营养和机体激素信号之间的相互作用使得生长发育迅速进行。在哺乳动物中，出生后的生长受促生长轴的活动控制，其中生长激素影响肝脏和外周组织产生胰岛素样生长因子-1以促进器官和全身生长。急性营养不良会导致消瘦，即严重的体重减轻。而慢性营养不良则会引发生长激素抵抗状态，从而导致发育迟缓。即使营养状态恢复也无法完全解除生长激素抵抗，难以挽救患者的生长发育状态。这个现象与肠道微生物特征群落似乎存在着必然联系，然而其对出生后正常发育生长的贡献及其对慢性营养不良期间促生长轴活动的影响仍然未知。
2016年法国里昂高等师范学院的FRANÇOIS LEULIER教授在Science上发表了植物乳杆菌可以增强慢性营养不良小鼠生长激素敏感性的研究成果（Lactobacillus plantarum strain maintains growth of infant mice during chronic undernutrition）。时隔六年，该团队再次在Science上发表植物乳杆菌促进营养不良小鼠生长发育的相关工作。作者团队补充了植物乳杆菌（LpWJL株）对抗营养不良缺陷生长的机制，并进一步探究这种特定菌群作用的分子生物学机制。LpWJL菌株中分离的胞壁酰二肽与米伐木肽单独应用依旧可以引发整菌诱导的相同作用，并且该机制与肠上皮细胞的NOD2蛋白息息相关。这预示着，纯化的植物乳杆菌细胞壁多肽或者NOD2配体再配合上营养补充，可以有效挽救慢性营养不良对患者生长发育的负面影响。
示意图
改良饮食诱导的小鼠发育不良模型：
作者团队首先构建了一种更加贴合现实患者病历的传统小鼠慢性营养不良模型，设计一种基于AIN93G的低脂肪和蛋白质的改良等热量饮食（MAL）。与AIN93G常规饮食（CON）小鼠相比，MAL饮食小鼠的体重和体重增加发生了严重降低。出生后第56天MAL小鼠发育迟缓，体型和股骨长度更短。随着整体体重增加降低，单个器官的最终重量也降低。这种发育迟缓不是食物摄入量变化的结果，甚至MAL组的相对食物摄入量有所增加。
生长因子IGF-1是出生后生长主要内分泌的决定因素，营养不良时其产量和活性降低。外周组织中的IGF-1产生由GH信号激活，生长激素受体在发育迟缓小鼠肝脏中的表达显著降低。肝脏是循环IGF-1的主要来源，但MAL组的肝脏重量更低，血清、肌肉和肝脏中的IGF-1水平也较低，表明MAL组肝脏产生IGF-1能力受到抑制。与CON组相比，MAL组禁食后的胰岛素和葡萄糖循环水平显著降低。总之，作者团队为了进一步研究植物乳杆菌作用机制，建立了一种新的小鼠慢性营养不良临床前模型，该模型会导致严重发育不良，与IGF-1和胰岛素水平低有关。
图 低蛋白和脂肪饮食可诱导C57Bl / 6J幼年雄性小鼠发育迟缓
LpWJL治疗改善生长发育：
作者团队先前的工作已经证明了，LpWJL菌株在营养缺乏的情况下维持果蝇幼虫的生长和发育（Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing）。在慢性营养不良的无肠道菌群小鼠模型中也观察到这种菌株促进生长的特性。
进一步验证其在传统的营养不良小鼠模型中是否仍保留其对幼年生长的正面作用。LpWJL给药使得实验组在8周龄时比安慰剂组长3.5%，重10%，改善了小鼠的生长与体重。在治疗5周后，LpWJL给药导致股骨变长，肾脏、附睾脂肪和肌肉组织质量增加。必须要提到的是不同组别之间的食物摄入量或相对食物摄入量没有显著差异性。接下来，作者团队验证了LpWJL治疗对MAL喂养小鼠的IGF-1和胰岛素循环水平以及相关信号通路影响。与安慰剂组相比，LpWJL治疗小鼠血清中IGF-1水平显著增加，肝脏的IGF-1和GHR相对表达也在中增加，表明GH敏感性更高。生长激素信号通路转录靶基因Socs1、Socs2和Socs3表达增加的支持了上述推断。同时肝脏中Akt的Ser473点位磷酸化显著增加，这伴随着血清中空腹胰岛素水平的增加，表明这些动物中InR/IGF-1R通路的活性更高。因此，LpWJL治疗改善了血糖控制，这反映在腹腔内葡萄糖注射后更快的葡萄糖清除。这些数据与最近的一项临床研究一致，在该研究中，作者报告了接受微生物群指导食物治疗的严重急性营养不良孟加拉国儿童IGF-1和胰岛素水平的显著增加。
图 LpWJL治疗改善出生后营养不良小鼠生长发育
LpWJL的促生长作用基于细胞壁组分，并存在菌株特异性：
由于作者先前的工作在果蝇模型上证明了植物乳杆菌的促进生长作用存在菌株特异性。为了确定这种菌株特异性在常规小鼠中是否也成立，使用植物乳杆菌LpNIZO2877进行验证。与安慰剂治疗类似，LpNIZO2877的给药对体长和股骨生长没有影响。LpWJL和LpNIZO2877维持血清IGF-1和胰岛素水平的能力不同。LpNIZO2877治疗对MAL小鼠的血糖控制没有影响，在葡萄糖耐量试验期间的葡萄糖清除没有显著作用。这些数据表明，在传统营养不良动物模型中，植物乳杆菌的生长促进特性是菌株特异性的。
在果蝇模型中发现，植物乳杆菌细胞壁（CW）片段与宿主之间的相互作用在植物乳杆菌介导的生长促进中起着重要作用。热灭活（HK）LpWJL处理MAL小鼠。HK LpWJL治疗效果与活LpWJL治疗效果相近，HK细菌治疗导致血清中IGF-1和胰岛素水平升高，并在葡萄糖耐量试验期间降低血糖。从LpWJL或LpNIZO2877中分离出CW并给药MAL小鼠。与安慰剂治疗组相比，LpWJL CW治疗显著增加体长增长率与股骨长度，并升高血清中IGF-1和胰岛素水平升高。而LpNIZO2877 CW治疗没有显著效应。这些数据表明，LpWJ分离的CW足以支持慢性营养不良期间改善生长和葡萄糖代谢。
图 LpWJL促进生长和代谢作用是菌株特异性的，可通过分离细胞壁重现效应
NOD2是LpWJL介导的生长促进所必需的：
HK LpWJL和从LpWJ分离的CW可以被宿主识别，并诱导代谢和激素变化，从而改善慢性营养不良期间的生长动力学。依据先前报道的文献，确定了一组与细菌CW识别的先天免疫受体。与LpNIZO2877CW相比，LpWJL CW显著增加了NOD2受体介导的信号传递。进一步验证NOD2介导的信号通路在LpWJL改善生长动力学中的必要性，使用NOD2缺陷（NOD2−/−）小鼠。对照组为（MyD88−/−）缺陷小鼠，MyD88为对几个TLR信号传导至关重要的适配分子。与安慰剂治疗组相比，NOD2−/−小鼠未能从LpWJL治疗中获益。LpWJL治疗的NOD2−/−小鼠血清中IGF-1和胰岛素无显著变化。与NOD2−/−小鼠相比，营养不良的MyD88−/−小鼠受益于LpWJL治疗。
使用NOD2活化衍生物细菌CW衍生的胞壁酰二肽（MDP）或NOD2激活佐剂米伐木肽治疗小鼠模拟LpWJL的疗效。MDP给药小鼠的体长和股骨长度有所改善，但没有达到LpWJL治疗小鼠的程度。MDP给药增加IGF-1水平，但未能增加胰岛素水平或葡萄糖清除率。米伐木肽治疗效果类似，IGF-1和胰岛素均增加但葡萄糖清除率没有差异。这些结果证实NOD2介导的信号传导对于LpWJL介导的生长促进和代谢效应是必要的，并且合成的NOD2配体可以部分模拟LpWJL效应。
图NOD2对LpWJL介导的生长促进和代谢效应是必要的
NOD2是LpWJL促进小肠Ki67细胞数量增加所必需的：
与CON喂养的动物相比，MAL喂养的小鼠小肠隐窝中的Ki67细胞数量较少，这表明在慢性营养不良期间，肠上皮的更新率较低，肠干细胞（ISC）的功能也有所改变。此前也有报道称，小肠隐窝中的NOD2刺激有助于ISC的生存和功能。通过转录组分析，发现LpWJL治疗上调了I型干扰素相关基因。NOD2的刺激已被证明可诱导I型干扰素应答，同时I型干扰素在肠上皮稳态中发挥重要作用。LpWJL治疗的野生型小鼠每个肠隐窝中Ki67细胞的数量增加，对于NOD2−/−小鼠每个肠隐窝中Ki67细胞数目与对照组无显著差异。此外，LpWJL治疗的野生型小鼠上调了Ifit3、Ifit1和Igtp的表达。
图 NOD2依赖性LpWJL治疗促进小肠中Ki67细胞增殖和I型IFN相关基因表达
肠道局部组织中表达NOD2是LpWJL介导的生长促进所必需的：
在WT和NOD2−/−小鼠中观察到的LpWJL治疗后小肠的变化表明，肠隐窝中NOD2的信号介导可能是LpWJL改善慢性营养不良期间生长动力学的关键。使用组织特异性NOD2 KO策略，构建NOD2的肠上皮细胞（IEC）特异性Cre驱动基因耗竭（NOD2ΔIEC）模型。LpWJL治疗的NOD2fl/fl小鼠体长增长率与IGF-1水平有所提高，而安慰剂和LpWJL治疗的NOD2ΔIEC组之间没有显著差异性。与所有其他组相比，LpWJL处理的NOD2fl/fl小鼠肠隐窝中的Ki67细胞数量显著增加，I型IFN相关基因的表达增加。这些结果表明，肠上皮细胞室需要NOD2来支持LpWJL介导的肠道反应和生长促进。
图 肠隐窝中LpWJL的NOD2依赖性信号介导的必要性
小结：
作者团队的实验结果证实，用细菌菌株LpWJL或其CW治疗通过协调幼年宿主的代谢和激素变化，提高IGF-1和胰岛素的循环水平，以支持慢性营养不良幼鼠的出生后生长。纯化CW支持生长的能力，以及细菌介导的生长促进表型的菌株特异性，表明宿主机制在识别细菌CW以缓解慢性营养不良时的发育迟缓方面发挥了重要作用。作者团队证明了细菌CW的关键信号传导分子NOD2对于LpWJL促进生长是必要的，并且NOD2配体亦可改善的生长。这项发现可以与补充营养策略相结合，使用益生菌（如LpWJL）或相关信号受体激动剂（如LpWJLCW和NOD2激动剂）极有可能解除慢性营养不良对生长发育造成的长期干扰。这将造福中低收入国家近乎1.49亿的5岁以下营养不良的儿童。
NOD2是一种在肠上皮细胞和免疫细胞中表达的固有免疫受体，可维持肠道炎症和免疫稳态。慢性营养不良会减少增殖性ISC的数量，导致绒毛变短，吸收上皮细胞数量减少，总体上导致小肠吸收面积减少，营养吸收减少。而NOD2也在肠隐窝的ISC中高表达，LpWJL治疗促使小肠隐窝中Ki67数量的增加，但在NOD2−/−小鼠中治疗无效。因此LpWJL很有可能是通过NOD2依赖性细菌细胞壁组分识别对抗营养不足对小肠隐窝细胞增殖的负面影响，从而改善了营养吸收，表现为营养敏感的GH/IGF-1/胰岛素轴活性增加。然而，这一假设需要进一步验证。
参考文献：
（本文）Martin Schwarzer, Umesh Kumar Gautam, Kassem Makki, et al. Microbe-mediated intestinal NOD2 stimulation improves linear growth of undernourished infant mice. Science. 2023 Feb 24;379(6634):826-833.
https://www.science.org/doi/10.1126/science.ade9767
（前置研究）Martin Schwarzer, Kassem Makki, Gilles Storelli, et al. Lactobacillus plantarum strain maintains growth of infant mice during chronic undernutrition. Science. 2016 Feb 19;351(6275):854-7.
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aad8588
（前置研究）Gilles Storelli 1, Arnaud Defaye, Berra Erkosar, et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 2011 Sep 7;14(3):403-14.
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(11)00306-8
