核酸适配体——短的单链 DNA 或 RNA 分子，可以选择性地以高特异性结合靶标（肽、蛋白质、碳水化合物）——已成为分子识别中抗体的有希望的替代品。适配体拥有独特的特点，如高稳定性、成本效益高的大规模合成、批次间差异最小、非免疫原性，以及对特定位点的化学修饰的适应性。尽管适配体具有吸引人的特点，但它们在生物传感中的应用仍然受到限制，主要原因是缺乏适用于各种生物分子目标的高质量适配体。标准的适配体选择过程 SELEX——通过指数富集对配体进行系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）——由于需要多个循环，因此需要大量人力和时间，并且无法预测或编程生成的适配体的目标亲和力 (K_d)。

于此，加拿大多伦多大学Shana O. Kelley院士等人开发了一种称之为“Pro-SELEX”的改进方法，该方法能够定量分离具有可编程结合亲和力的适配体。在轮次选择中，该创新方法集粒子展示、磁珠分选、高维平行选择、高含量生物信息学于一体。成果发表在Nature Chemistry上。

上海交通大学樊春海院士和宋萍等人对该研究成果进行评述。

最近为提高 SELEX 适配体选择的效率、选择性和速度所做的努力提供了几种技术，例如反 SELEX、非 SELEX、M-SELEX 和CE-SELEX，但这些方法仍然需要多个选择周期。其他方法包括适配体促进生物标志物发现，它使用适配体作为探针来识别和验证新的生物标志物；以及高通量测序方法，可以并行分析数千到数百万个适配体序列。然而，这些方法都不能定量生成具有明确结合亲和力的适配体。

该研究团队展示了具有可定制结合亲和力的适配体的可编程选择。使用乳液 PCR 将每个适配子候选物转化为适配子颗粒，这样每个颗粒在其表面上携带多个拷贝的单个核酸序列。这些颗粒与不同浓度的生物素化结合靶标一起孵育。靶点与这些适配体颗粒的结合水平取决于靶点浓度和它所包被的适配体的结合亲和力。通过用抗生物素磁性纳米颗粒（其数量与结合的分析物分子的数量相关）标记适配体颗粒，然后可以根据它们的磁性含量将这些颗粒分类到微流体芯片隔室中。

研究人员设计的 Pro-SELEX 芯片包含四个捕获区，每个捕获区都有不同的线速度，允许根据不同的磁性水平对粒子进行分类。第一个区域（与更高的目标结合亲和力相关）显示出最高的线速度，由于磁力超过了流速增加带来的拖曳力，因此保留了具有高磁性含量的颗粒。他们设计的芯片能够根据粒子的磁性含量（即它们的目标结合亲和力）对粒子进行分类。适配体池是从四个隔室中的每一个中收集的材料创建的，并进行了测序。比较生物信息学用于分析单个适配体的展示，验证真阳性命中并推断相对亲和力范围。

图|Pro SELEX能够选择具有不同结合亲和力的适配体

该团队将Pro-SELEX应用于适配体选择，使用人髓过氧化物酶（MPO）作为模型结合靶标。首先，他们预先富集了一个随机 DNA 文库，然后通过乳液PCR制备适配体粒子文库。然后在五个浓度的人髓过氧化物酶上对文库进行测试，以分离在不同范围内具有特异性结合亲和力的适配体。Pro-SELEX 芯片对文库进行分选仅需20分钟即可分选出5 × 10⁷个适配体颗粒，这比基于荧光激活细胞分选的方法更快。对收集到的颗粒进行高通量测序，并开发了一种称为 AptaZ 的评分工具来分析富集并生成 Z 分数，即每个候选适配体的富集倍数。选择具有不同 Z 分数的八个候选适配体进行表征，显示出对人髓过氧化物酶的亲和力，K_d 值范围为 227 pM 至 27.8 nM。K_d 值和 Z 分数之间的线性关系表明可以使用 Z 分数来识别具有所需结合亲和力的候选适配体。

基于观察到的K_d值和 Z 分数之间的相关性，研究人员为经过验证的人髓过氧化物酶适配体生成了一个搜索带。设定了所需的K_d值及其理论 Z 分数范围，并选择了该范围内的候选适配体并检查了结合亲和力。“非常适合”被定义为实验K_d值与所需K_d值之间的差异小于 25%。识别“非常适合”的成功率为20-50%，这表明在 Z 分数范围内测试多达五个适配体候选物可以识别出具有所需结合亲和力的候选物。选定的适配体在常见血清蛋白中表现出对人髓过氧化物酶的优异特异性，突出了它们在分析生物样品中的潜在用途。

图|基于Z评分的具有所需亲和力的抗MPO适配体的定量分离

这种适配体选择技术的发展代表了分子识别领域的重大进步。实现的具有选择亲和力的适配体的可编程分选扩展了潜在的应用。高亲和力适配体适用于快速灵敏的即时应用，而低亲和力适配体由于其结合和解离速度快，因此适用于实时监测。具有可编程亲和力的适配体不仅适用于小目标，而且适用于病毒和细菌。例如病毒中和适配体。适配体选择方法也可以直接在生物样本中执行，无需进一步优化即可生产可穿戴和治疗用途的适配体。

图|Pro SELEX与当前适配体选择技术的比较

然而，使用这种方法选择K_d值低于 10 pM 的高亲和力适配体以进行高灵敏度检测，而不是低亲和力适配体仍然是一个挑战。潜在的解决方案包括使用更大的初始适配体候选池和高亲和力适配体的重选策略。此外，掺入非天然核苷酸可以增强结合并扩大目标范围。随着研究人员在适配体选择中探索 Pro-SELEX，适配体驱动的创新在化学、医学和环境科学中的应用将得到扩展。

参考文献：

1. Chang, D., Wang, Z., Flynn, C.D. et al. A high-dimensional microfluidic approach for selection of aptamers with programmable binding affinities. Nat. Chem. 15, 773–780 (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41557-023-01207-z

2. Song, P., Fan, C. Selecting aptamers with programmed affinities. Nat. Chem. 15, 747–748 (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41557-023-01215-z