Nature Nanotechnology：小小纳米孔，大大的能力！
小奇
奇物论
2023-10-16
血清生物标志物对于诊断疾病、监测治疗效果和预测患者预后至关重要。传统上，血液检测的重点是检测指示疾病的特定蛋白质，最近，还使用了检测 microRNA (miRNA) 和与病理相关的小分子的方法。尽管取得了重要进展，检测方法仍然受到特异性有限、测定时间和成本限制、样本量要求大和生物标志物覆盖不完整的困扰。鉴于生物分子在疾病过程中复杂的相互作用，从单一生物标志物检测到分析物多重检测的转变已经获得动力，希望为疾病提供更全面的病理生理学见解。对于能够同时检测复杂生物液体中的多种生物标志物以改善医疗保健并实现即时诊断的分析方法的需求尚未得到满足。由于生物标记物的性质多种多样，从蛋白质和肽到小分子和 miRNA，这项任务提出了巨大的挑战。一个能够检测整个分子阵列的单一平台将标志着该领域的关键发展。帝国理工学院Joshua B. Edel、Aleksandar P. Ivanov等人开发了一种检测平台，将纳米孔测序与DNA条形码分子探针相结合，用于多重检测分析物，包括蛋白质、小分子和 miRNA。研究人员设计的检测策略利用纳米孔测序、DNA 条形码分子探针和适体技术，以多重形式准确检测多种生物标志物。在纳米孔测序中，单个DNA分子首先在施加的电势下进入孔，然后通过解旋酶马达逐个碱基地通过孔。在此过程中，流经孔的离子电流取决于流经孔的碱基序列，从而产生电流与时间的信号。为了针对特定的生物标志物，研究人员设计了由三个关键区域组成的 DNA 探针：接头、目标结合区域和条形码。适配器区域在探针之间是通用的，并且包含在测序过程中通过孔馈送探针时控制探针易位速度的运动蛋白。靶标结合区域对于被测分析物是特异性的：它要么是结合miRNA或DNA的互补序列，要么是选择性结合特定蛋白质或小分子的适体序列。在测序过程中，在解旋酶马达沿着链前进时，当它遇到探针区域提供的结构屏障时，它会经历暂时的停顿，但仅当该区域与其目标分子结合时。与来自不受该结构障碍物约束的探针的信号相比，这种遭遇导致电信号的延迟或停滞。电信号的这种明显延迟表明目标分子存在于链上。此外，通过区分显示这些信号延迟的测序事件和不显示这些信号延迟的测序事件，还可以确定样品中分析物的浓度。这是通过计算已延迟的读取比例来实现的。最后，每个探针中都包含一个独特的条形码区域，使分析物的多重检测成为可能。在测序过程中，适配器区域首先进入孔，然后是条形码区域，其序列可以被碱基调用以识别每个特定探针及其相关的目标分析物。为了展示该平台，研究人员成功检测了 miRNA、蛋白质和小分子，例如与心血管疾病相关的神经递质。他们首先通过设计40个条形码探针并将它们与每个miRNA靶标单独孵育来演示序列特异性miRNA检测。对于研究的每个 miRNA 靶标，当测序过程中存在靶标时，观察到延迟信号的百分比显著增加，而没有观察到条形码序列的影响。为了展示整合条形码如何实现多个目标的多重检测，将40个条形码探针与不同浓度的40个miRNA 目标一起孵育，然后进行测序。使用比对协议，信号被解复用并按条形码序列分组。使用为每个探针构建的浓度百分比延迟曲线，可以在所有分析物的实际浓度的一个数量级内确定40个测试miRNA中的每一个的浓度。图|使用条形码探针和纳米孔测序对40种miRNA、蛋白质和小分子进行分离除了检测同一分子物种的多种分析物外，DNA条形码分子探针与纳米孔测序相结合的多功能性使同时检测多种分析物成为可能。研究人员证明，使用他们的平台在单个实验中检测miRNA、蛋白质和小分子的组合是可能的。在结合各种分析物类别的双链和三链实验中，与不添加靶分子的对照实验相比，观察到miRNA、蛋白质和小分子靶标的每个条形码探针的延迟事件百分比显著增加。在适应性平台内检测和量化单分子水平上多种生物标志物的能力对于诊断应用具有重要意义。在现有的血液生物标志物检测分析中，提取和扩增步骤的需要可能会增加测试时间（导致样本损失，例如在 miRNA 快速降解的情况下）并给测量带来偏差。该研究开发的平台可以直接从人血清中进行生物标志物检测，无需提取或扩增步骤。然而，蛋白质需要过滤步骤以防止大蛋白质堵塞孔。未来的工作需要确定区分相似 miRNA 序列的限制，降低假阴性率，并探索靶标结合区域的选择性，以扩大可检测的生物标志物的数量。Koch, C., Reilly-O’Donnell, B., Gutierrez, R. et al. Nanopore sequencing of DNA-barcoded probes for highly multiplexed detection of microRNA, proteins and small biomarkers. Nat. Nanotechnol. (2023).https://doi.org/10.1038/s41565-023-01479-z
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