人们发现，酶催化剂具有优异的立体选择性，但是酶催化剂的反应性控制和自由基立体控制远远不如化学催化剂。人们通过研究焦磷酸硫胺素（ThDP, Thiamine diphosphate）依赖酶，发展了N杂环卡宾，但是目前还没有能够不对称自由基催化转化的相关方法学。而且由于自然更倾向于避免形成对生物体有害的自由基物种，因此目前还未曾发展一种具有生物兼容和普适性的自由基生成机理。 有鉴于此，南京大学黄小强、梁勇和中国科学技术大学田长麟等通过蛋白质工程，并且将酶催化与有机光催化剂结合，发展了一种ThDP裂解酶进行立体选择性自由基酰基转移酶RAT（radical acyl transferase）。在光照射作用下，光催化-酶催化体系通过光激发有机染料分子的单电子氧化生成酮自由基，随后能够与前手性烷基自由基以立体选择性方式偶联。这种光-酶催化体系能够从醛和氧化还原活性酯原料生成多种多样的酮，在35个反应例子中，立体选择性ee最高达到97 %。反应机理研究结果显示，这是个未曾报道的酶催化/光催化体系，能够导向自由基在ThDP辅酶进行立体选择性的反应。这项工作不仅拓展了生物催化的应用，而且发展了控制自由基与酶反应的独特方法，这种独特的方法与目前的化学催化反应方法学能够互补。通过酶催化的立体选择性与光催化结合，实现控制自由基中间体的立体反应选择性。自由基应用场景广泛，但是控制自由基的化学反应选择性非常困难自由基是反应活性非常高的反应中间体，自由基在天然产物合成、材料科学、药物、工业制造等多种领域表现广阔应用前景。但是自由基物种具有非常高的反应活性，导致调控自由基中间体的化学反应选择性和立体选择性一直都是巨大的困难与挑战。
大多数的酶通常以两电子反应过程，以单电子转移反应方式进行的自由基酶比较罕见。比如，ThDP酶广泛存在于许多有机体，通常ThDP酶能够以亲核加成方式将不同的碳阴离子烯胺（Breslow反应中间体）与亲电试剂进行C-C偶联反应或者切断C-C化学键。一个比较重要的ThDP酶催化反应是苯甲醛裂解酶催化苯偶姻缩合反应（benzoin condensation）。 目前报道的非常罕见的例子中，人们发展了丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR, pyruvate:ferredoxin oxidoreductase）实现了单电子氧化反应方式对CoA实现乙酰基化。但是ThDP是否能够以立体方式进行自由基转化还并不了解。通过优化反应体系改善反应体系催化活性。使用4-甲氧基苯甲醛和N-(酰氧基)邻苯二甲酰亚胺反应物，在体系中加入ThDP酶和eosin Y光催化剂。并且在530-540 nm和N2气氛进行催化反应，筛选多种ThDP酶，考察最合适的酶。发现荧光假单胞菌PfBAL（Pseudomonas fluorescens ）具有一定的酶催化活性，目标产物的产量能够达到33 %，立体选择性ee为38 %。通过迭代位点突变策略优化立体选择性。通过对各种突变的变体筛选，发现其中T481L_A480L变体给出较好的立体选择性，立体选择性达到96 %。通过智能和高质量的变体优化策略，获得了反应性能合适的RAT2酶。随后对光催化剂、反应缓冲液pH、助溶剂、ThDP的量等反应参数优化，目标产物的产量达到60 %，立体选择性达到96 %。
反应体系表现了对位修饰供电子/缺电子的芳基醛（3a-3m）表现优异的兼容性，邻位和间位修饰的底物同样具有可接受的反应性（3n和3o），但是反应产物产率和立体选择性有所降低。对于修饰卤原子（3h-3k, 3w-3aa）、萘（3p），以及吡唑（3q）、吡啶（3r）、苯并噻吩（3s）、N-甲基吲哚（3t）等杂芳烃醛同样表现很好的反应活性。对于N-(酰氧基)邻苯二甲酰亚胺等底物能够转化为α-手性酮，具有较好的产率和优异的立体选择性（86-97 % ee）。这种光-酶催化反应方法能够将多种市售消旋药物大分子转化，比如loxoprofen（3ae，洛索洛芬）、flurbiprofen（3af，氟比洛芬）、天然有机醛（3ag）。此外，能够将脂肪族自由基（3ad）、大体积叔碳自由基（3ai）立体选择性催化转化，因此说明该反应的广阔应用前景。作者考察该反应的大量合成，发现能够将1 mmol量级的3a和3g转化，产率分别达到52 %和85 %。该反应方法具有条件温和、普遍适应、官能团兼容性好等优势，因此能够用于合成重要的α-手性有机酮。
基于相关文献，提出光催化和酶催化双重机理。首先ThDP与有机醛分子反应生成关键Breslow中间体（Int.A），Int.A容易发生单电子氧化。Eosin Y发生光激发生成激发态的eosinY*，激发态的氧化电极电位为E1/2(eosinY*/eosinY·-)=+0.83 V。通过单电子转移生成酮自由基物种Int.B和eosin Y自由基阳离子。Eosin Y能够还原N(酰氧基)-邻苯二甲酰亚胺生成前手性苯甲基自由基Int.C。最后Int.B和Int.C发生自由基偶联构筑C(sp2)-C(sp3)化学键，得到产物分子，同时重新形成具有催化活性的RAT。此外，作者通过DFT理论计算和MD分子动力学模拟，研究该反应立体选择性的原因。 Yuanyuan Xu, Hongwei Chen, Lu Yu, Xichao Peng, Jiawei Zhang, Zhongqiu Xing, Yuyan Bao, Aokun Liu, Yue Zhao, Changlin Tian, Yong Liang & Xiaoqiang Huang, A light-driven enzymatic enantioselective radical acylation. Nature (2023)DOI: 10.1038/s41586-023-06822-xhttps://www.nature.com/articles/s41586-023-06822-x
