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研究背景
从致癌诱变剂和早期疾病标记物到环境污染物和生物恐怖制剂的检测，对复杂混合物中极低浓度的各种分子进行定量检测一直是许多科学和工程领域的主要目标。因此，开发无需外部标记或修改即可检测这些分析物的技术非常有价值，也是这些领域进行定量检测的首选。在这方面，表面增强拉曼光谱可以仅根据其内在和独特的振动特征来检测复杂混合物中的分子种类。
关键问题
1、表面增强拉曼光谱对于单分子的定量检测重现性和准确性差由于不同的分子取向和异质电磁场等因素，表面增强无法得到很好的控制，导致显着的单分子强度波动（SIF）。因此，基于所有单分子信号积分强度的定量（即模拟测量）在低浓度下变化很大，无法达到所需的重现性和准确性。2、基于固体基质的表面增强拉曼光谱可靠性和灵敏度受限即使在严格的制造条件下，固体基质在给定基质中和不同基质之间也是异质的，并且由于测量过程的不可逆性，这些差异无法通过校准来纠正。此外，固体基质中有限的热点数量以及目标捕获的不可逆性导致合格的单分子事件很少，严重限制了基于固体基质的方法的可靠性和灵敏度。
新思路
有鉴于此，上海交通大学叶坚等人提出了一个概念证明，表明使用数字（纳米）胶体增强拉曼光谱，可以通过单分子计数常规地实现对极低浓度的各种目标分子的可重复定量，仅受测量过程的泊松噪声限制。由于增强这些振动特征的金属胶体纳米颗粒（包括羟胺还原银胶体）可以在常规条件下大规模制造，预计数字（纳米）胶体增强拉曼光谱将成为可靠和可靠的技术的首选技术。该技术可以对各种分析物进行超灵敏检测，包括对人类健康非常重要的分析物，为表面增强拉曼光谱的应用提供了研究基础。1、提出了数字（纳米）胶体增强拉曼光谱（dCERs）概念作者开发了基于银胶体的增强拉曼光谱，并验证了其单分子灵敏度以及通过双分析物 SERS 技术进行单分子计数的适当范围。 作者量化了dCERs测量的准确性，结果表明每个浓度测得的单分子事件的相对标准偏差（RSD）符合泊松分布。作者分别通过分散在同一溶液中的不同浓度的两种不同目标分子的混合物、百草枯及福美双的低浓度定量检测，证实了DCERs的有效性。作者通过分散在水溶液中的金属胶体纳米颗粒，广泛的分子目标的单分子拉曼特征得到充分增强，从而能够识别目标单分子。2、获得了超低浓度目标分子的可靠定量检测（毫摩尔级）并且通过单分子计数，这些目标分子可以以前所未有的精度进行可重复量化，最终的检测水平仅受测量过程的泊松噪声限制。作者使用含有10μl金属胶体悬浮液的石英毛细管来生成目标分子的增强拉曼光谱，使用扫描探针系统以逐点扫描模式获取每个样品的拉曼光谱，使用银胶体是因为它们在测量过程中具有分散稳定性，并且具有出色的拉曼增强能力。借助该系统，首先使用羟胺还原银(Hya–Ag)胶体(ζ)验证了其单分子灵敏度以及通过双分析物SERS技术进行单分子计数的适当范围，但由于目标-热点相互作用的复杂性，单分子计数的适当浓度范围预计会在很大范围内变化。因此，必须预先确定预期目标分子的适当单分子范围，以满足数字（纳米）胶体增强拉曼光谱（dCERS）的要求。此外，作者通过检查不同浓度的代表性目标分子证明了dCERS 的概念。 接下来，作者试图量化这些测量的准确性，使用结晶紫和 Hya-Ag 胶体作为测试用例，在多个浓度下进行了多次测量，并计算了每个浓度的平均值和测量误差。结果表明每个浓度测得的单分子事件的相对标准偏差（RSD）符合泊松分布，变化为1/√N，其中N是阳性单分子事件的总数每次测量共有 5,400 个体素。因此，随着测量更多的正体素，特定浓度的单次测量的准确性必须提高，这将需要采集更多的体素，从而需要更长的测量周期。结果强烈表明，基于离散单分子事件的测量通常应在很大程度上遵循泊松分布，因此，可实现的测量精度应由累积的正事件决定（和预测），而这仅受无论分析物浓度或特定系统的检测效率如何，可接受的测量持续时间和测量期间（背景）假阳性的数量。当RPV及其不确定度已知时，可以从预校准的对应曲线中恢复实际分析物浓度及其准确性。 为了进一步证明dCERS的有效性，作者对分散在同一溶液中的不同浓度的两种不同目标分子的混合物（结晶紫和尼罗蓝）进行了定量。结果都显示出与仅存在一种分析物时测量的相同关系。此外，尽管两种分析物的相对浓度存在两个数量级差异，也可以准确测定结晶紫和尼罗蓝的浓度。从每种混合物的三次重复测量计算出的标准偏差也与泊松统计一致。这些结果表明，只要分析物浓度满足单分子要求，即足够低，dCERS就可以仅根据多种目标分析物在宽浓度范围内的特征 SERS 特征来实现同时定量。作者通过通过检查溶液中的微量百草枯进一步测试了 dCERS 的检测能力，通过测试溶解在湖水中的百草枯证实了此类测量可以在类似于现场情况的复杂且无特征的背景下实现准确定量。作为其有效性的最终证明，作者还应用dCERS来检测杀菌剂福美双，证明了dCERS在检测极低浓度的可溶性靶分子方面具有无与伦比的优势。
展望
总之，该研究表明基于单分子计数的 dCERS 是一种有效且高效的超低浓度分子定量技术，只要目标分子表现出明确的、特定的光谱特征以及与热点的充分相互作用，就可以仅仅基于目标分子的固有振动特征进行分子定量。前所未有的灵敏度和可预测的准确性使 dCERS 成为一种强大的、甚至可能是高要求应用的首选技术，包括环境保护、食品安全和诱变剂检测。Bi, X., Czajkowsky, D.M., Shao, Z. et al. Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting. Nature (2024).https://doi.org/10.1038/s41586-024-07218-1
