髓样细胞是肿瘤微环境 （TME） 中最丰富的免疫细胞，人们对治疗靶向它们的抗肿瘤作用非常感兴趣。TAM密度的增加与某些癌症临床结果的改善相关，通过阻断 CD47-SIRPα 轴增强 TAM 吞噬活性介导几种临床前模型中的抗肿瘤作用。CD47-SIRPα轴阻断剂的临床试验表明，当与其他药物联合使用时，在某些液体肿瘤中具有抗肿瘤活性，但缺乏单药活性或在实体癌中的临床证据。因此，尽管付出了广泛的努力，但缺乏针对 TAM 以获得临床益处的治疗方法。过继转移的T细胞和旨在阻断CD47-SIRPα轴的药物是有前途的癌症疗法，可以激活免疫系统的不同分支。但抗CD47 抗体与过继转移的 T 细胞联合使用，由于巨噬细胞介导的了 CAR-T 细胞的快速清除，并未观察到明显的治疗益处。
(Crystal L Mackall 医学博士是斯坦福癌细胞治疗中心的创始主任、斯坦福癌症研究所副所长和癌症免疫治疗项目负责人。2022年被评为美国癌症研究协会院士与美国国家医学院院士。她的工作主要才基础免疫学出发，主要关注儿童癌症。她领导了许多首次人体和儿童临床试验，涵盖树突状细胞疫苗、细胞因子以及使用 NK 细胞和转基因 T 细胞的过继免疫疗法。)近日，美国斯坦福大学斯坦福癌症研究所癌细胞治疗中心的Crystal L Mackall院士团队报道了一种工程化CD47表达CAR-T细胞疗法。这种 CD47 变体 CD47(Q31P)(47E)与 SIRPα 结合并提供“不要吃我”信号，该信号不会被抗 CD47 抗体阻断。表达 47E 的 TCR 或 CAR T 细胞在用抗CD47 抗体治疗后对巨噬细胞清除具有抵抗力，并介导大量、持续的巨噬细胞募集到肿瘤微环境。尽管许多募集的巨噬细胞表现出 M2 样特征，但联合治疗协同仍增强了抗肿瘤疗效。巨噬细胞被确定为 T 细胞持续性的主要调节因子，并指明将 T 细胞定向疗法与巨噬细胞激活疗法相结合的根本挑战。工程化 CD47 提供了一种能够同时利用 T 细胞和巨噬细胞的抗肿瘤作用的治疗方法，增强了对实体瘤的杀伤效力。抗 CD47 消除 CAR T 和 TCR T 细胞疗效：为了验证通过 CD47 阻断增强巨噬细胞吞噬作用可以提高 CAR T 细胞疗法疗效的假设，将 HER2-BBζ CAR T 细胞和/或抗 CD47 单克隆抗体 B6H12对 143B 骨肉瘤荷瘤小鼠进行治疗。单独使用CAR T细胞诱导抗肿瘤作用，但添加抗CD47抗体消除CAR T细胞功效。为了研究双重治疗治疗失败的原因，定量B7H3-BBζ CAR T 细胞 ± B6H12 治疗后荷瘤小鼠的人 T 细胞。B7H3-BBζ CAR T细胞加B6H12治疗小鼠的肿瘤和血液中完全不存在人T细胞，但仅用CAR T细胞治疗的小鼠中存在。抗CD47抗体可诱导过继转移的T细胞快速耗竭，包括那些被设计为表达转基因TCR或具有不同靶向和共刺激结构域的CAR细胞。图1 抗CD47抗体通过巨噬细胞介导的T细胞耗竭消除过继转移的T细胞功效确定 T 细胞消融是否通过 FcR 介导的抗体依赖性吞噬作用发生，使用CV-1，一种与 CD47 结合但不与FcR 结合的融合蛋白。与 B6H12 的结果类似，CV-1 消除了 CD19 CAR T 细胞对Nalm6-fLuc小鼠的抗肿瘤功效，并诱导接近完全 T 细胞耗竭。使用 CRISPR-Cas9 敲除 CD47 来测试过继转移 T 细胞的存活是否需要 CD47 表达。47WT型CAR T 细胞在 Nalm6-fLuc 小鼠中扩增并介导了强大的肿瘤控制并显着延长了生存期，而47KO CAR T细胞耗尽，没有抗肿瘤活性。（CD47 的过表达）47OE 与体内对照组相比，CD19-28ζ CAR T 细胞介导的长期抗肿瘤疗效明显更好，T 细胞存续更好。总而言之，过继转移 T 细胞的存活需要 CD47 表达和SIRPα 参与，并且 CD47 过表达增强了 CAR T 细胞的持久性和疗效，即使在没有 CD47 阻断剂和没有免疫排斥的情况下也是如此。验证巨噬细胞在介导抗CD47诱导的T细胞耗竭中的作用。在 B6H12 给药之前，进行巨噬细胞耗尽，发现巨噬细胞耗竭小鼠的 CAR T 细胞数量显着升高，即使在没有 CD47 阻断的情况下也是如此。巨噬细胞确定为过继转移的 T 细胞植入和抗肿瘤功效的障碍。进一步解释了将抗CD47与过继性T细胞疗法相结合是徒劳的，并暗示巨噬细胞介导的吞噬作用是T细胞在体内存续的重要调节因子。研究原代人巨噬细胞在体外吞噬原代人T细胞的潜力。转导表达CAR的T细胞被吞噬水平明显高于正常T细胞，且B6H12给药进一步增加吞噬水平。巨噬细胞吞噬作用受“吃我”信号的平衡调节，例如钙网蛋白7，以及“不要吃我”信号，例如 CD47。CD47在CD4和CD8 T细胞之间以及T细胞分化状态间的表达相对均匀，但CD47在培养物中的表达随时间推移而降低，而钙网蛋白表达在同一时期增加。这解释了老化的CAR T细胞更容易受到吞噬作用。从接受商业 CD19-28ζ CAR T 细胞治疗的患者身上收集的脑脊液 （CSF） 的常规细胞学分析显示，组织细胞吞噬淋巴细胞，与巨噬细胞介导的吞噬作用一致。为了更系统地解决这种可能性，分析了从最近两项 axi-cel 临床研究中收集的单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 数据。两个数据集都证明了骨髓细胞中存在CAR mRNA，与巨噬细胞介导的人类CAR T细胞吞噬作用一致。这些数据提供了进一步的证据来支持骨髓细胞吞噬CAR T细胞，因此可能限制过继转移细胞的持久植入或活化T细胞在临床环境中的存活。基于上述研究，抗CD47介导的T细胞耗竭可以作为一种现成的安全开关来减轻CAR T细胞的毒性。为了测试这一点，使用一种多特异性整合素结合肽（PIP）CAR，靶向在多种恶性肿瘤中表达的整合素16。PIP CAR T细胞在体外介导了有效的活性，但用PIP CAR T细胞治疗的载骨肉瘤小鼠表现出急性毒性。即使在非荷瘤小鼠中，用PIP-28ζ CAR T细胞治疗也很快导致毒性。相比之下，联合B6H12 的 PIP-28ζ CAR T 细胞治疗没有表现出任何明显的毒性或体重减轻，包括血液中没有检测到的人类细胞因子。在异种移植模型中，CAR T 细胞存续延长可导致移植物抗宿主病 （GvHD）。为了确定抗 CD47 治疗是否可以持续预防 GvHD，监测用 CD19-BBζ CAR T 细胞治疗的 Nalm6 小鼠。48 天后，观察到用CD19-BBζ CAR T 细胞治疗的小鼠出现 GvHD，表现为脱发和体重减轻，而用 CAR T 细胞联合 B6H12 治疗的小鼠没有发生 GvHD。这些数据表明，CD47阻断有望作为消除CAR-T细胞相关毒性的现成安全开关，严格的急性毒性模型和慢性CAR T细胞毒性模型的挽救证明了这一点。为了通过 CD47 阻断诱导选择性肿瘤吞噬作用，同时保护 T 细胞免受吞噬作用，作者团队试图设计一种 CD47 变体，该变体可拒绝抗 CD47 结合但保留 SIRPα 相互作用。使用FACS对酵母显示的 CD47 突变变体库进行六次连续分选，在针对 B6H12 的阴性分选和针对 CV-1 的阳性。最终分类中的所有变体都包含单个A30P（CD47（A30P））或Q31P（CD47（Q31P））点突变。当在酵母上显示为具有游离CD47 N末端的单个CD47变体时，表现出不与 B6H12 的结合，但保留了与 CV-1 和 SIRPα 正常或增强的结合。CD47的BC环突变，特别是Ala30和Gln31，产生的蛋白质保留SIRPα结合，但免于与多种抗CD47单克隆抗体结合，为设计“不要吃我”信号CD47变体的能力提供了概念证明。这些变体不会被抗CD47单克隆抗体阻断， 这将驱动肿瘤特异性吞噬作用，同时保留 TME 中的 T 细胞。接下来，测量人类供体巨噬细胞对47KO Jurkat细胞的吞噬作用，这些细胞被改造为表达CD47WT、CD47（A30P）或CD47（Q31P）。在多个供体中，在B6H12与任一变体孵育后，巨噬细胞介导的吞噬作用显著降低，但与CD47（Q31P）相比，CD47（A30P）提供的保护较少，CD47（Q31P）完全阻止了B6H12孵育后的额外吞噬作用。基于这一结论，继续研究CD47（Q31P）即47E（工程化CD47）。图4 CD47 的工程变体保留与 SIRPα 的结合，但不再与抗 CD47 抗体结合将CFSE 标记的 HER2-BBζ CAR T 细胞被瘤内注射到原位肿瘤中，肿瘤样本显示巨噬细胞浸润明显，而B6H12治疗后CAR T细胞减少和CFSE巨噬细胞增加的趋势。接下来用47WT或47E HER2-BBζCAR T细胞处理143B荷瘤小鼠，B6H12不影响47E-CAR T细胞受体中的TME巨噬细胞水平，但显著降低了47WT-CAR T中的巨噬细胞水平。通过scRNA-seq分析证实，CAR T细胞和巨噬细胞肿瘤浸润高度相关，这与CAR T淋巴细胞将巨噬细胞募集到肿瘤中的模型一致，并且巨噬细胞的募集取决于CAR T在肿瘤中的存续。47WT和47E CAR T细胞scRNA-seq图谱显示T细胞表达显著表达TNF、IFNG、CCL3、CCL4、CCL5、CSF1和CSF2，它们共同吸引和激活单核细胞和巨噬细胞，并与T细胞介导的巨噬细胞募集到肿瘤中有关。在接受或不接受B6H12治疗的情况下，47E CAR T细胞治疗的基因表达基本上没有变化。而与接受47WT CAR T与B6H12联合治疗相比，接受47E CART与B6H12联合治疗TME中的T细胞显示出595个差异表达基因（DEG），包括增加的促炎基因集，如IL-12、CD40/CD40L和NF-κB信号传导。这些数据为47E-CAR T细胞TME内的髓细胞和T细胞之间的实质性串扰提供了证据。接下来评估47WT或47E T细胞加抗CD47治疗在多种肿瘤模型中的抗肿瘤作用。在143B中，CAR T细胞和抗CD47疗法作为单一疗法的效果最小。用B6H12处理后，47WT CAR T细胞完全耗尽，而47E CAR T淋巴细胞持续数周。只有B6H12加47E-CART细胞诱导肿瘤生长的显著延迟和总生存率的提高。在转移性神经母细胞瘤中，将B6H12与47WT和47E B7H3-BBζCAR T细胞配对，并观察到47E CAR T淋巴细胞加B6H12增强了持久性和提高了抗肿瘤疗效。在患有Nalm6-fLuc白血病的小鼠中，47E与47WT CD19-28ζCART细胞加B6H12增强了抗肿瘤功效。这些数据表明，CD47阻断与表达47E的治疗性T细胞配对可保护T细胞免受巨噬细胞介导的吞噬作用，并导致巨噬细胞在TME内大量持续流入，这与T细胞-巨噬细胞的串扰有关。其结果是在实体、液体和转移性肿瘤中具有强大的抗肿瘤协同作用。图5 47ET 细胞疗法加抗 CD47 治疗通过招募不同的巨噬细胞群来增强抗肿瘤功效先前的研究报告称，CD47是防止免疫排斥所必需的。CD47 过表达与 MHC 敲除相结合使CAR T 细胞对抗同种异体免疫排斥反应。但是作者团队研究结果表明，即使在没有免疫排斥反应的情况下，CD47也是过继转移T细胞存活所必需的，CD47过表达可提高CAR T细胞的存续和疗效。NSG小鼠中的抗CD47处理诱导巨噬细胞介导的过继转移T细胞的快速和完全耗竭。其反应足够快速和有效，足以在致命的CAR T细胞毒性模型中介导完全保护，这可能具有立竿见影实现临床受益。这些结果与数据一致，表明CD47敲除CAR T细胞在异种移植模型中被迅速清除，以及观察到 Cd47 和 Sirpa 敲除小鼠的总淋巴细胞和抗原特异性淋巴细胞减少、感染易感性增加和自身免疫易感性降低。尽管CD47阻断大大增强了T细胞耗竭，但即使在没有CD47-SIRPα阻断的情况下，巨噬细胞吞噬作用也限制了过继转移的T细胞的持久性。临床scRNA-seq数据也发现了髓系细胞内的CAR mRNA。总之，这些发现与巨噬细胞吞噬作用在调节T细胞稳态中起重要作用的模型一致。在长时间培养后，T细胞上“吃我”信号的表达增加，CD47的表达减少，提出了CD47-SIRPα轴可能类似地调节衰老T细胞清除率的前景。未来的研究需要更好地定义T细胞活化和分化、促吞噬和抗吞噬受体的表达以及吞噬作用敏感性之间的关系。作者团队观察到CAR T细胞诱导巨噬细胞快速涌入肿瘤，巨噬细胞的持续募集取决于CAR T细胞的存续。结果，47ECAR T细胞受体在TME中表现出髓样细胞和T细胞之间的广泛串扰，包括T细胞中IL-12、CD40L和NF-κB信号传导的诱导。因此，47E保护 T 细胞免受 CD47 介导的吞噬作用，同时增强肿瘤吞噬作用、抗原呈递和诱导促炎性 TME。需要更多的研究来测试 47E在完全免疫功能正常的系统中，以了解对其他免疫细胞类型的影响，包括内源性 T 细胞和自然杀伤细胞。虽然 B6H12 是一种研究级抗体，但本研究中产生的 CD47 变体也对抗了与临床级抗体 TJC4（lemzoparlimab）的结合，这将预测 47E可以将过继疗法与临床级抗 CD47 抗体配对。Sean A Yamada-Hunter, Johanna Theruvath, Brianna J McIntosh, et al. Engineered CD47 protects T cells for enhanced antitumour immunity. Nature. 2024 May 15.https://www.nature.com/articles/s41586-024-07443-8
