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原创丨米测MeLab

编辑丨风云

研究背景

2022年塑料产量达到 4 亿吨，其中包装和一次性塑料占了很大一部分。产生的废物最终被填埋、焚烧或排放到环境中，造成环境污染。转向可生物降解和可堆肥的塑料越来越多地被视为一种有效的废物管理替代方案。聚乳酸 (PLA) 被普遍认为是一种可生物降解的聚合物。2022年，PLA占生物塑料市场的 20.7%（46 万吨），由于大规模的工业投资，预计到 2027 年这一比例将迅速增长到 37.9%（240 万吨）。

关键问题

然而，PLA的生物降解主要存在以下问题：

1、PLA在家庭堆肥和土壤条件下的生物降解率仍然很低

尽管 PLA 被普遍且误导性地认为是一种可生物降解的聚合物，但它仅在温度高于 60°C 的工业堆肥条件下才能有效降解，它在自然环境（如土壤和水环境）和家庭堆肥中的温和条件下表现出非常低的生物降解性。

2、开发一种可在自然环境中自降解的 PLA 材料具有应用前景    

土壤微生物可以同化PLA降解释放的小低聚物和单体， 因此开发一种可在自然环境中自降解的 PLA 材料可以减轻一次性塑料废物的积累。在塑料材料中嵌入解聚酶是一种创新方法，但主要限制因素是酶活性不足以及将粉末状酶引入 PLA 的过程，这阻碍了其在薄包装中的使用。

新思路

有鉴于此，图卢兹大学A. Marty、I. André等人介绍了一种基于PLA的塑料，其中嵌入了优化的酶，以确保在室温下快速生物降解和可堆肥，且使用可扩展的工业工艺。首先，通过基于结构的合理工程设计一种新的超热稳定PLA水解酶，实现了80倍的活性增强。其次，通过基于母料的熔融挤出工艺将酶均匀分散在 PLA 基质中。通过 70°C下熔融挤出，将液态酶配方加入低熔点聚合物聚己内酯中，形成“酶化”聚己内酯母料。母料颗粒在 160°C 下通过熔融挤出与 PLA 结合，产生酶化 PLA 薄膜（0.02% w/w 酶），该薄膜在家庭堆肥条件下在20-24周内完全分解，符合家庭堆肥标准。酶化薄膜的机械和降解性能与工业包装应用兼容，并且在长期储存期间保持完好无损。这种创新材料不仅为堆肥和生物甲烷生产开辟了新途径，还为PLA降解提供了可行的工业解决方案。    

技术方案：

1、表征了PLAase性能

作者从嗜热菌中提取了PLA解聚酶PAM，新发现的PAM酶在高温和碱性条件下，PLA解聚性能优于蛋白酶K，但需优化以适应近中性pH。

2、研究了基于结构的 PAM PLAase 工程

通过高分辨率X射线衍射技术，解析了PAM蛋白结构，并通过分子模拟和实验证实了改良变体PAMFLI显著提升PLA解聚效率和稳定性。

3、开发了结构工程策略将耐热蛋白T作为新的PLAase支架

作者通过结构工程策略，发现超热稳定 PLA 解聚酶 ProteinT^FLTIER，活性和热稳定性显著提升。

4、探究了酶解PLA材料的生物降解性

作者讨论了ProteinT^FLTIER 酶变体在生产酶化聚合物中的应用，证实了ProteinT^FLTIER 酶变体显著提升 PLA 聚合物的生物降解性和环保处理潜力。

技术优势：    

1、开发了可扩展且经济高效的熔融挤出工艺

作者开发了一种可扩展且经济高效的熔融挤出工艺，以酶促 PLA 基聚合物生产可自降解的材料。这种创新需要一种高效的热稳定酶，能够在 PLA 中混合后在 160°C 左右保持其活性。

2、成功分离并纯化了一种新的PLA解聚酶

作者从嗜热菌 Actinomadura keratinilytica T16-1 中成功分离并纯化了一种新的PLA解聚酶 (PLAase)，通过全RNA测序和N端测序，确定了编码 386个氨基酸多肽的全长RNA，其活性依赖于 N 端前结构域的裂解。

技术细节

PLAase性能表征

新发现的PLA解聚酶PAM从嗜热菌中提取，在大肠杆菌中生产并纯化。研究比较了大肠杆菌生产的pro-PAM与蛋白酶K在不同pH和温度条件下的PLA解聚性能。与蛋白酶K相比，PAM 在家庭堆肥条件下表现更优，尤其在高温和 pH 9.0 下，解聚率可达 96%，而蛋白酶 K 仅为 18%。但PAM在pH 7.5和28°C时活性显著降低，表明需进一步优化其在近中性pH条件下的性能。    

图  PLA解聚酶PAM优于蛋白酶K

基于结构的 PAM PLAase 工程

通过高分辨率X射线衍射技术，确定了PAM蛋白的三维结构，揭示了其催化机制。利用分子动力学模拟和位点饱和诱变技术，优化了PAM的PLA解聚性能。改良的PAMFLI变体在pH 7.5和9.0下表现出显著提高的比活性，尤其在pH 7.5下，比活性在28°C和45°C下分别提高了6倍和4.5倍。在45°C和pH 7.5下24小时内，PAMFLI实现了90%的PLA解聚，而天然PAM仅20%。优化后的PAMFLI不仅提高了PLA解聚效率，还保持了与PAM相同的热稳定性，显示了其在工业应用中的潜力。    

图  PAM PLAase的结构洞察

图  位点饱和诱变提高PAM对PLA的解聚活性

耐热蛋白T作为新的PLAase支架

作者通过结构工程策略，从超嗜热细菌中发现了一种超热稳定 PLA 解聚酶 ProteinT^FLTIER。通过将 PAMFLI 的催化特性转移到 ProteinT，显著提升了其 PLA 解聚活性和热稳定性。ProteinT^FLTIER 在 pH 7.5 下比活性比 ProteinT 高 35 至 80 倍，在 45°C 下24小时 PLA 转化率达 89%。其 T_m 值高达 79.4°C，比 PAMFLI 高 21.6°C，显示了其在家庭堆肥应用中的潜力。ProteinT^FLTIER 在不同 pH 和温度条件下均表现出稳定的活性，适合在家庭堆肥环境中使用。    

图  ProteinT和aqualysin-I与PAM PLAase的PLA解聚性能比较

图  耐热 ProteinT的PLA解聚活性提高

酶解PLA材料的生物降解性

ProteinT^FLTIER 酶变体通过液体酶制剂的形式被引入 PLA 聚合物，显著提高了其生物降解性。这种酶制剂不仅改善了酶在聚合物中的分散性，还通过母料方法和阿拉伯胶保护提高了酶的稳定性。在水生物降解测试中，ProteinT^FLTIER 薄膜在高温和高 pH 条件下表现出优异的降解能力。此外，该薄膜在家庭堆肥和工业堆肥条件下均显示出良好的崩解和生物降解特性。嵌入ProteinT^FLTIER生产的PLA基材料可以通过厌氧消化设施处理以产生生物甲烷。值得注意的是，使用PLA + MBs + ProteinT^FLTIER 薄膜，23 天内碳转化率达到 91%，而无酶 PLA + MBs 薄膜对照在孵育30天后未观察到生物降解，该策略为塑料废弃物的环保处理提供了新的可能性。    

图   酶解PLA材料的水性生物降解性得到改善 

图  在家庭堆肥条件下，PLA 薄膜的分解是由ProteinT^FLTIE的加入引发的

展望

总之，作者通过从自然多样性中寻找PLAase候选物，然后使用计算机辅助工程策略提高其活性，从嗜热菌中分离出的两种天然 PLAase，即 PAM 和 ProteinT，被鉴定并进一步工程化，以提高它们在 pH 7.5 和 45°C 下的 PLA 解聚活性。PLA + MBs + ProteinT^FLTIER薄膜表现出良好的水生物降解性能，在家庭堆肥条件下，培养20至24周后完全分解。此外，薄膜的机械性能和生物降解性均在18个月的储存期内保持良好，证明了酶解材料的耐久性和稳定性。酶解 PLA 材料进一步表明符合工业堆肥要求，因为 PLA + MBs + ProteinT^FLTIER 薄膜在不到一个月的时间内就完全生物降解，而无酶PLA + MBs薄膜对照则需要3个多月的时间。 

参考文献：

Guicherd, M., Ben Khaled, M., Guéroult, M. et al. An engineered enzyme embedded into PLA to make self-biodegradable plastic. Nature (2024). 

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07709-1