第一作者：李茂霖
赵惠民教授，现任美国伊利诺伊大学厄本那-香槟分校（UIUC）化学与生物分子工程系Steven L. Miller讲座教授，美国NSF人工智能分子合成研究所主任，美国化学会ACS Synthetic Biology期刊主编。赵教授予1992年取得中国科学技术大学生物学学士学位；1998年在诺贝尔化学奖获得者Frances Arnold教授的指导下，获得加州理工学院化学博士学位。此后，在美国陶氏化学公司担任工业生物技术实验室项目负责人；2000年加入UIUC独立开展研究，2008年晋升为正教授。赵教授作为蛋白质工程与合成生物学领域的先驱之一，主要研究兴趣是开发和应用合成生物学、机器学习和实验室自动化工具，解决健康、能源和可持续发展等领域的重大挑战。赵教授在Nature、Science、Nature Chemistry、Nature Biotechnology、Nature Catalysis、Chemical Reviews等国际期刊发表论文440余篇，申请专利30余项，受邀495次大会报告、主题演讲和特邀演讲。赵教授培养的学生和博士后中，有37位成为了国内外知名院所的教授或首席研究员，为我国的生物催化与合成生物学领域培养了一大批优秀的青年人才。赵教授曾获AAAS Fellow、AIMBE Fellow、AIChE Daniel I.C. Wang奖、AIChE FP&B分会奖、ECI酶工程奖、ACS Marvin Johnson奖和SIMB Charles Thom奖等诸多荣誉。 能够催化氟化物反应的酶非常罕见，这导致生物合成技术制备药物、农药、材料学等领域常用的氟化物非常困难。有鉴于此，伊利诺伊大学厄本那-香槟分校赵惠民教授等开发了光酶催化技术，实现了烯烃的不对称氢氟烷基化。光诱导黄素依赖性烯还原酶（flavin-dependent ene-reductases）的混杂酶能够从氟碘烷烃产生碳自由基，并且通过光酶诱导进行烯烃的立体选择性氟官能团化。通过氟化结构和酶之间的相互作用实现立体结构控制，能够在氟烷基的β、γ、δ位点立体化学方式进行酶催化氢原子转移（这个过程对于化学催化转化反应非常困难）。这项研究为开展含氟化合物的酶催化转化技术以及氟化物的不对称催化转化提供帮助。通常化学催化反应能够处理各种氟化物（氟甲基、二氟甲基、氧三氟甲基、巯基-三氟甲基）的反应，但是化学催化的问题在于难以利用远离立体结构中心的氟官能团实现更高的立体选择性。产生这个问题的原因在于，氟化结构难以与催化剂之间产生强相互作用，使得催化剂的手性无法传播到催化位点偏远的位置。酶催化剂的本征结构使得其能够与氟化官能团之间产生多种相互作用，在活性位点附近产生遍布分散的手性环境，因此有助于解决远离活性中心位置手性的困难。此外，人们发现光酶催化能够拓展酶催化的应用和反应场景。黄素单核苷酸（FMN，flavin mononucleotide）还原酶能够通过立体选择性HAT反应控制前手性碳中心自由基，FMN酶通过对反应物的光生电子转移，提高反应物的能量，使得反应物处于不稳定状态，随后释放离去基团，形成自由基并捕获自由基。作者首先挑选合适的氟化试剂，发现具有合适的离去基团的氟化试剂通过光酶催化反应产生含氟的碳中心自由基。随后含氟自由基被烯烃捕获，通过酶HAT实现在分子上安装远程立体碳原子。这种设计能够在分子内的β、γ、δ远端位点引入立体中心，该过程通过化学催化反应无法实现。 FMN还原酶通常容易与含有丰富羰基、氰基、硝基官能团的反应物结合，一些研究结果显示FMN混杂酶能够与含有吡啶结构或者磺酰基结构的反应物结合进行光酶催化。通过利用这种混杂性特点，作者研究了有可能与FMN兼容的氟化物。 使用巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）的OYE1作为催化剂，使用α-甲基苯乙烯作为自由基接受分子，筛选氟化物。此外筛选的时候通过GDH-NADP+-Glu体系循环产生NADPH。研究发现，2-吡啶磺酰氟（PyFluor）、甲苯磺酸三氟甲基酯（TFMT）、三氟甲磺酸乙酯（TFETf）没有反应活性，Togni II试剂具有一定活性（产率<10 %）。但是作者发现三氟碘乙烷是比较合适的氟化物，能够以20 %的产率生成γ手性位点，立体选择性达到92 % ee。随后，结合以往的研究，优化改善氟化试剂的反应活性。研究不同的FMN酶的反应活性，并且改变可见光、添加剂、溶剂等反应条件，发现野生老黄酶（OYE3）是最合适的催化剂，产率达到80 %，立体选择性达到93 % ee。在相同反应条件下，对比的OYE1酶的反应产率仅为65 %，立体选择性为92 % ee。控制实验结果显示，对于该反应，酶、光、GDH都是必不可少的。使用各种α-甲基乙烯基芳烃作为烯烃反应物，发现三氟碘乙烷（TFIE）是合适的氟化试剂。对于含有各种官能团的反应物，该反应能够以中等或较高的收率进行反应（收率：37~99 %），很好的立体选择性（69~99 % ee）（化合物1-13）。对于各种含烯基的芳烃（呋喃、噻吩、苯并二恶英和吡啶）同样表现高产率（49-99 %）和较高的立体选择性（88-99 % ee）（化合物14-17）。作者发现电子浓度更高的烯烃对于缺电子三氟乙基自由基的亲和性更强，因此具有更高的反应活性。该反应对于α-乙基苯乙烯（18）的反应性较差，说明反应受到α-烷基的立体位阻的影响。拓展氟化物反应物的种类。使用多氟碘烷修饰β-立体中心，能够以31-84 %的收率和90-98 % ee立体选择性生成目标产物（化合物19-26）。使用多氟亚甲基碘化物作为原料，能够安装γ-立体中心，产率达到42-80 %，立体选择性达到92-99 % ee（化合物27-30）。当氟官能团和碘之间含有两个亚甲基的氟反应物，能够安装δ-立体中心。控制反应显示，野生黄酶OYE1和OYE3的反应活性较差，不仅产率低，而且立体选择性只有70 % ee。反应性能降低的原因主要有两点：氟原子数目少导致与酶之间的相互作用更小，氟官能团与自由基中心的距离变化导致降低自由基亲和性。 为了解决OYE1和OYE3的低反应活性，使用定向诱变技术改善光酶催化剂，使用1,1-二氟-2-碘乙烷和α甲基苯乙烯作为反应物，通过结构对接给出活性位点的氨基酸基团的低能量构象。发现增加N194侧链的大小能够显著改善产率和ee。OYE3_N194Y变体的产率能够提高至65 %，而且ee选择性仍达到87 %。通过分子对接（molecular docking）和集群建模（cluster modeling）研究反应机理。作者将关键酪氨酸基团（Y375、Y196和Y82）突变为苯丙氨酸。发现减少酪氨酸基团导致降低反应活性，其中，OYE1_N194Y的反应产率达到82 %，立体选择性达到91 % ee，而且当使用OYE3_N194Y作为催化剂甚至达到等物质的量的产率。这些研究结果说明络氨酸基团能够非常好的调节底物-酶之间的相互作用，与理论计算的预期结果相符。 通过同位素标记实验研究不对称HAT反应机理。在Glu-GDH-NADP+体系，D-葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7作为反应物（非氘代的柠檬酸盐缓冲液），并且使用氘代FMNhq。通过理论计算研究亲核进攻步骤和HAT步骤。其中双自由基IntA作为起始的中间体，随后非结合的α-甲基苯乙烯与三氟乙基自由基反应生成IntB。IntB中间体随后在自由基进攻形成IntC。最后从FMNsq得到氢原子生成最终产物。HAT步骤包括两个自由基发生结合，电子自旋从三线态变成单线态。在这项研究，作者发展了FMN光酶用于烯基芳烃安装氟化官能团，从而填补了自然界酶催化的空白。使用FMN还原酶的反应活性，并且结合FMN还原酶能够形成限域环境用于HAT，实现了化学催化反应难以得到的反应效果。通过理论计算研究揭示酶和氟化底物之间的相互作用，弄清了产生立体选择性的原因。这项工作拓展了酶催化氟化的方法，有助于精确选择性安装不对称结构的氟官能团。Maolin Li et al., Asymmetric photoenzymatic incorporation of fluorinated motifs into olefins. Science 385,416-421(2024). DOI: 10.1126/science.adk8464https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk8464
