化学反应在特定隔室中的物理分离是细胞代谢的标志。模块化酶，如蛋白酶体，通过在按顺序组织的特殊催化结构域中处理底物来执行复杂的任务。受这些自然机器的启发，人造生物室已被实现在细胞和无细胞环境中重建和操纵代谢途径。虽然大多数系统依赖于基于蛋白质和脂质的构建块的周期性自组装，但基于核酸的方法，特别是DNA折纸方法，能够为每个核碱基制造可编程形状和已知空间坐标的三维（3D）结构。这允许以亚纳米精度对折纸表面进行功能化。此外，还开发了模块化装配程序，以指导将多个结构有序地组合成微米级的大型装配。总之，这些特征已被用于研究空间限制和分子间距离对单个酶或酶对活性的影响。为了模拟天然模块化酶的复杂性，一个重要的挑战是控制多个反应的顺序。
成果简介
鉴于此，德国杜伊斯堡-埃森大学B. Saccà、H. Meyer等研究人员利用DNA的可编程性来设计一个具有多催化功能的模块化和分区化结构。
该人工嵌合体将蛋白质分离和解折叠过程与下游的蛋白水解反应相结合，从而产生26S蛋白酶体的半合成原型：一种自区室化和解折叠酶辅助的蛋白质降解机器。通过精确控制化学计量、空间排列和解折叠机的单向取向，该设计提供了一种底物特异性的网关机制，用于调节底物进入、解折叠和加工到下游蛋白水解模块。研究人员发现，虽然空间限制提高了每个催化步骤的速率，但模块的物理连接进一步提高了级联的整体性能，并最大限度地减少了脱靶相互作用。最后，通过修改下游模块的活性，研究人员为不同的任务重新编程嵌合体，展示了该方法在选定底物上工程生物催化途径的潜在用途。
研究数据显示，虽然空间限制将单个反应的速率提高了十倍，但将分隔的酶物理连接成嵌合体有效地将这两种反应结合起来，并将脱靶蛋白水解减少了近六倍。因此，该模块化方法可以作为设计人工纳米工厂的蓝图，这些工厂具有重塑的催化性能和功能，超出了在自然系统中观察到的。
模块化酶的纳米级模型
该模块化嵌合体反应由两个主要步骤组成：首先由细胞稳态、增殖和信号传导中具有重要作用的valosin-containing protein (VCP)/p97催化，它是一种蛋白质解折叠机器；其次是α-胰蛋白酶(aCt)催化，这是一种S1家族中研究广泛且稳定的丝氨酸蛋白酶。作为ATP酶，p97由两个六聚体环(D1和D2)组成，中间有一个狭窄的通道，N端结构域附着在D1环上，C端尾部附着在D2环上。在细胞内，p97招募泛素化底物蛋白，为它们在蛋白酶体中的降解做准备，或者以一种不依赖泛素的方式将底物蛋白定向回收。研究人员体外重建了一个不依赖泛素的分离和解折叠途径，并将其作为模型的上游反应。具体来说，抑制剂-3 (I3)底物与PP1和SDS22辅因子结合形成SP-I3复合物，通过适配蛋白p37直接被p97招募。添加ATP后，I3解折叠并与结合伙伴分离。
为了有效地将底物解折叠与蛋白水解消化相结合，p97机器必须足够接近aCt，但又必须物理上分离以防止非特异性蛋白水解。这可以通过首先将每种酶固定在适当的隔室中实现，然后将两个不同装载的隔室连接成一个嵌合体。隔室应允许封装单个p97蛋白，同时允许其机械运动和足够的结合伙伴空间，这对于p97的正确功能至关重要。隔室还应允许控制性装载胰蛋白酶，并实施模块化组装策略。最后，由于底物穿行反应严格单向，即从p97的N端到C端，需要满足两个关键条件：(1) p97孔必须与DNA隔室的中心轴线对齐，以确保解折叠的底物无阻碍地转移到蛋白水解模块；(2) p97在DNA隔室内的相对方向必须已知并唯一定义，以确保所有构建物具有相同的N到C的底物转移方向。
图| 一个模块化的纳米级分区模型
模块化舱室的设计和组装
研究人员设计了一种DNA折纸结构（Nemesis, NE），它是一个25 nm宽、41 nm高、53 nm长的六角形空心棱柱，由两个相同的部分（Narcissus (N) 和 Echo (E)）通过核苷酸碱基互补连接而成。这个结构旨在匹配p97的大小和形状，同时确保有足够的空间供其与蛋白伙伴结合和无阻碍的机械运动。为了简化，研究人员将修改后的NE隔室称为“A”或“B”，分别代表上游和下游模块，后面跟着上标表示盖子的数量（例如AL表示一个盖子，A2L表示两个盖子）。隔室内腔的功能化通过带有单链突出臂（PA）进行，用下标表示（例如APA）。整个嵌合体将被命名为AB。
图| DNA折纸舱室的设计和表征
解折叠机器的空间限制
研究人员设计了一种DNA折纸结构，通过将p97蛋白与荧光标记的DNA手柄结合，成功地将p97蛋白封装进DNA隔室。通过原子力显微镜和透射电子显微镜验证了p97蛋白与DNA隔室的结合，并且发现p97蛋白在隔室内主要呈现一种特定的方向，即N端结构域指向外部。冷冻电镜数据进一步证实了这种定向，显示p97蛋白与DNA隔室的中心轴线共轴对齐。这种设计不仅实现了p97蛋白在隔室内的特定定位，还为底物提供了一个单向的转移通道，解决了系统的主要结构挑战。
图| p97机器的封装
底物在上游模块中解折叠
作者研究了DNA隔室化对p97蛋白活性的影响。通过将底物I3与光活化蛋白mEos融合，研究人员能够监测p97解折叠底物的过程。实验中，研究人员使用了不同的DNA隔室，并通过荧光变化来追踪底物的解折叠。作者发现，当p97被限制在DNA隔室内时，其解折叠底物的速率显著提高。特别是，当隔室上游空间受限时，解折叠速率进一步增加。此外，多室结构中附加的空腔室也能加速解折叠反应。这些结果表明，空间限制可以提高p97的活性，可能通过增加局部底物浓度或提高蛋白质的构象稳定性。通过优化隔室设计，研究人员可以进一步提升p97的解折叠效率。
下游模块中的蛋白质降解
研究人员通过将α-胰蛋白酶(aCt)共价修饰上带有荧光的单链DNA，成功制备了酶-DNA共轭物，并将其固定在DNA折纸隔室中。实验显示，这种固定化显著提高了aCt的催化效率，尤其是在隔室内含有更多PA臂时。此外，研究人员对SP–I3mEos复合物进行了蛋白水解实验，发现I3部分容易被降解，而mEos部分则较抗蛋白酶。计划通过在p97解折叠后立即进行蛋白水解来提高效率。
图| DNA分区对酶活性的影响
模块化嵌合体使底物解折叠和降解
研究人员测试了DNA隔室对不同分子的渗透性，发现小分子如寡核苷酸和α-胰蛋白酶可以进入，但大于45 kDa的蛋白则不能。这表明该隔室可以有效限制大分子复合物。研究人员进一步将p97解折叠模块与α-胰蛋白酶蛋白水解模块连接，构建了一个完整的底物解折叠和降解途径。通过琼脂糖凝胶电泳和透射电子显微镜成像，研究人员确认了模块的成功组装和功能。实验显示，将α-胰蛋白酶固定在DNA隔室内可以显著提高其催化效率，并减少自我降解。通过质谱分析，研究人员发现连接α-胰蛋白酶模块可以提高底物降解的效率。这些结果表明，模块化设计在提高酶活性和控制反应过程中具有显著优势。
图| DNA折纸嵌合体的组装和催化功能
设计底物特异性生物催化途径
为扩展该方法的应用范围，研究人员将p97驱动的解折叠过程与由Src（一种在胚胎发育和细胞生长调节中起作用的酪氨酸激酶）催化的磷酸化过程相耦合。研究人员期望通过这种人工设计的生物催化级联反应，增加底物解折叠后才能暴露的酪氨酸残基的磷酸化程度。
研究人员利用模块化组装获得了A(p97)/B(Src)嵌合体，并分析了在有无先前解折叠的情况下底物磷酸化的程度。结果显示，在添加ATP后，两种情况下都发生了底物磷酸化。然而，当两个酶模块按预定的顺序物理连接时，I3mEos上磷酸化酪氨酸残基的数量显著增加。这证明了以底物特异性方式发生的解折叠辅助磷酸化，并展示了该方法在对几乎所有I3标记蛋白执行翻译后修饰方面的通用性。
小结
研究人员设计了一种新型模块化酶，模拟26S蛋白酶体的功能，能识别、解折叠并消化特定底物。这种设计克服了传统DNA限制酶的局限，允许p97酶在有限空间内自由活动并正确定向。通过I3结构域，研究人员实现了对底物的特异性识别，这为在不同底物上进行定制化修改提供了可能。
尽管该系统对小于45 kDa的分子仍有渗透性，可能影响反应效率，但研究人员正在研究通过二氧化硅和共聚物涂层来降低这种渗透性。未来，研究人员计划增加半渗透屏障和刺激响应功能，以更精细地控制反应流程和分子的进出，从而推动新型生物催化途径的发展，创造具有超越自然系统能力的微型实验室。
参考文献：
Huang, J., Jaekel, A., van den Boom, J. et al. A modular DNA origami nanocompartment for engineering a cell-free, protein unfolding and degradation pathway. Nat. Nanotechnol. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41565-024-01738-7
