非血红素Fe(II)、α-酮戊二醛（α-KG）依赖性加氧酶是能够通过形成自由基之后进行一系列串联反应的酶家族。控制反应的路径具有较高的价值，并且是扩展生物催化反应的必要步骤和过程。人们开发了许多方法调控Fe^II/α-KG依赖性酶的反应路线，包括定点突变（site-directed mutagenesis）、DNA改组（DNA shuffling）、位点饱和突变（site-saturation mutagenesis）等方法。

有鉴于此，密歇根大学Alison R. H. Narayan等报道一种新型的序列重构技术，祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR），这种方法能够对进化信息精确的对控制反应路径的关键基团，随后通过组合定点突变方法快速的研究其中每个基团的重要性。

本文要点：

（1）

通过DNA改组（DNA shuffling）策略验证，并且通过量子力学/分子力学（QM/MM）计算模拟验证。通过这种方法，鉴定了一组活性位点基团，以及反应物和活性位点基团之间的氢键作用，对反应路径起到决定性影响。

（2）

成功的把具有苄基羟基化的现有以及古代酶都改造为能够进行扩环氧化反应的酶变体，展示了这种ASR技术加快反应路线调控的能力，能够对具有共同结构和机理特点的家族酶进行工程化的前景。

参考文献

Di Yang, Chang-Hwa Chiang, Taveechai Wititsuwannakul, Charles L. Brooks III, Paul M. Zimmerman, and Alison R. H. Narayan*, Engineering the Reaction Pathway of a Non-heme Iron Oxygenase Using Ancestral Sequence Reconstruction, J. Am. Chem. Soc. 2024

DOI: 10.1021/jacs.4c08420

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c08420